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3633
ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体
R
重组

ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb #3633

引用 (136)
筛选器:
  1. WB
  2. IP
  3. IHC
  4. F
Western Blotting Image 1: ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb
使用 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb 对 NCI-H2228 和 NCI-H3122 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。有必要显示融合不同 EML4 外显子(v1 或 v3)的变体。
No image available
Immunohistochemistry Image 1: ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb
使用 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb 对高水平(上)与低水平(下)表达 ALK 的石蜡包埋的人肺癌细胞进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 2: ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb
使用 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL) 进行免疫组织化学分析。
Immunohistochemistry Image 3: ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb
使用 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人非小细胞肺癌细胞进行免疫组织化学分析。
Flow Cytometry Image 1: ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb
使用 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线),对 U-937 细胞(蓝色)和 KARPAS 299 细胞(绿色)进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。
To Purchase # 3633S
目录# 规格 价格 库存
3633T
20 µl
3633S
100 µl

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 220 (ALK)、80 (NPM-ALK)、117 (EML4-ALK v1)、86 (EML4-ALK v3)
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:2000
免疫沉淀法 1:100
免疫组织化学(石蜡) 1:125 - 1:500
流式细胞术(固定/通透) 1:400 - 1:800

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)一起孵育,并且轻轻晃动且在室温下孵育 1 小时后,再检测 10 ml 封闭缓冲液中的生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:263

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用 Protein A agarose beads 对天然蛋白进行免疫沉淀,以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液与试剂

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS,将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。
  2. 10X 细胞裂解缓冲液:(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液,将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O,并混合。

    注意:使用前,请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein A Agarose Beads:(#9863)。
  5. 10X 激酶缓冲液(用于激酶试验):(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液,将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  6. ATP (10 mM)(用于激酶试验):(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM),将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS,每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
  6. 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清(可选)

  1. 涡旋振荡,以混合磁珠。
  2. 添加 10–30 µl 的 50% Protein A agarose beads 混悬液至 200 µl 细胞裂解物中 (1 mg/ml)。
  3. 在 4°C 下,旋转孵育 30–60 分钟。
  4. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
  5. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀法

重要提示:强烈建议使用相应的同型对照,以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗,把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗,把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗,把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗,把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗,Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配,并与一抗样品同时进行。

  1. 将一抗(按产品说明书中推荐的合适稀释比例配制)加入到浓度为 1 mg/ml 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下,旋转孵育过夜。
  2. 添加 protein A 琼脂糖(10–30 µl 的 50% 珠浆)。在 4°C 下,旋转孵育 1-3 小时。
  3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液,洗涤沉淀物五次。洗涤间期,保持样品于冰上。
  4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析(D 部分)。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
  2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  3. 对于 SDS-PAGE,将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

注意:当使用兔源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127)作为二抗,以尽量减少变性兔重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白,建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)(或 HRP conjugate #5127),以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时,我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗,以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物,并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟,然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
  7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。

发布​时间 2008 年 12 月

修订时间 2021 年 10 月

实验步骤编号:409

免疫组织化学(石蜡)

*重要信息: 相应的抗体稀释度,请参阅产品网页上的实验步骤。

A. 溶液与试剂

  1. 二甲苯
  2. 乙醇,无水变性,组织学分级(100% 和 95%)。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. Hematoxylin(可选)。
  5. 洗涤缓冲液
    1. 1X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST):要制备 1L 1X TBST,添加 100 ml 10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (#9997) 到 900 ml dH20 中,然后混合。
  6. 抗体稀释液: SignalStain® 抗体稀释液 (#8112)
  7. 1X EDTA 修复液:要配制 250 mL 1X EDTA 修复液,使用 225 mL dH2O 稀释 25 ml SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)。
  8. 3% 过氧化氢:要制备,添加10 ml 30% H2O2至90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液:TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum:要制备 5 ml 1X TBST,添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution:要制备4 mL 的 dH2O,添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统:SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物:SignalStain® DAB Substrate Kit (#8059)。
  12. 苏木精: Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂: SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意:在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤:
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次,每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。

C. 抗原修复

注释:本流程描述了使用 Biocare Medical Decloaking Chamber 的建议条件。设备专用设置和操作说明应用于其它加压蒸煮器。

  1. 将切片放入 250 ml 室温存放的 EDTA 修复液中,切片放在一个能放 24 个切片的切片夹上。
  2. 将 500 ml dH2O 倒入加压蒸煮器中。
  3. 将切片夹放入加压蒸煮器,直至接触到隔热板。再将一个能放 24 个切片的切片夹放入有 250 ml 水和空白切片的加压蒸煮器中,这样也许有好处。
  4. 密封蒸煮器室,并继续进行修复。以下为 Biocare Medical Decloaking Chamber 的设置。
    1. SP1 125°C 30 秒
    2. SP2 90°C 10 秒
  5. 小心给设备开排放口,随后取下盖子并将切片放在实验台上冷却 10 分钟。
  6. 用 dH2O 冲洗切片。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次,每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中,孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片 5 分钟。
  5. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液,在室温下封闭 1 小时。
  6. 清除封闭液,并向每块切片添加 100-400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent #8112 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain®Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit8114#) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液,并用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  9. 按需在切片上滴 1-3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit 8114#)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次,每次 5 分钟。
  11. 加入 1 滴 (30 µl) SignalStain® DAB Chromogen Concentrate 至 1 ml 的 SignalStain® DAB Diluent 中,使用前充分混合。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl SignalStain® DAB 并密切观察,通常 1–10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要,使用 hematoxylin (14166#) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次,每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水:
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次,每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次,每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (14177#) 封片。

发布​时间 2015 年 10 月

修订时间 2016 年 6 月

实验步骤编号:764

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
  5. 建议使用抗兔二抗:
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者,细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时,向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度,使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离,以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光。
  8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:404

特异性/灵敏度

ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb 可检测 ALK 总蛋白、ALK 融合蛋白(例如 EML4-ALK 变体和 NPM-ALK)的内源水平,即使在水平较低的情况下也可检测。该抗体不与其他家族成员发生交叉反应。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 ALK 羧基末端残基相对应的重组蛋白,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 是多效生长因子 (PTN) 的一种酪氨酸激酶受体,PTN 是与胚胎脑发育有关的生长因子 (1-3)。在表达 ALK 的细胞中,PTN 诱导 ALK 和下游效因子 IRS-1、Shc、PLCγ 和 PI3 激酶发生磷酸化 (1)。ALK 最初作为一种通过转位过程产生的核磷蛋白 (NPM)-ALK 融合蛋白发现 (4)。研究人员发现,NPM-ALK 融合蛋白是一种与间变性淋巴瘤相关的结构激活且会致癌的酪氨酸激酶 (4)。研究文献表明,NPM-ALK 激活 PLCγ 可能是有丝分裂活性的关键步骤,可能与间变性淋巴瘤的发病机理有关 (5)。
针对非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系的研究文献,描述了与 ALK 和棘皮动物微管相关蛋白样 4 (EML4) 的不同的 ALK 致癌融合蛋白,并且在某些肺腺癌病例中存在相应融合转录蛋白。微管相关蛋白 EML4 的短氨基末端区域能融合到 ALK 的激酶结构域 (6-8)。
研究人员发现,ALK 与其他融合伴侣(如 TRK 融合基因 (TFG) 和 KIF5B)易位,这还与 NSCLC 相关 (6,7)。尤其是,在 3-7% 的 NSCLC 样本中发现 EML4-ALK 融合蛋白 (6-14)。

通路

探索与本品相关的通路。

限制使用

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