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53509
ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体
R
重组

ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb #53509

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  1. WB
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Western Blotting Image 1: ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb
使用 ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb(上图)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图)对亲本 293T 细胞 (-) 或稳定转染带 Myc/DDK 标记的全长人 ADORA2A (hADORA2A-Myc/DDK; +) 表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
Western Blotting Image 2: ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb
使用 ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb(上图)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图)对 Kelly 和 A2780 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。A2780 细胞中 ADORA2A 蛋白的阴性表达与预测的表达模式一致。
Western Blotting Image 3: ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb
使用 ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb(上图)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图)对各种细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
Western Blotting Image 4: ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb
使用 ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E8M3W) Rabbit mAb(上图)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图)对用对照 siRNA (-) 或 ADORA2A siRNA (+) 转染的 Kelly 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
Flow Cytometry Image 1: ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb
使用 ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线)对 A2780 细胞(蓝色,阴性)和 Kelly 细胞(绿色,阳性)进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。
To Purchase # 53509S
目录# 规格 价格 库存
53509S
100 µl

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa) 45-60
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
流式细胞术(固定/通透) 1:100 - 1:400

保存

在 10 mM HEPES 钠 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中供应。-20℃ 保存。切勿分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

为了进行蛋白质印迹,在 4°C 将膜与 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中稀释的一抗孵育过夜,同时柔和振摇。

注意:请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备至检测,进行蛋白质印迹所需要的试剂现归于一个便利的试剂盒:#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS:将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O,混合。
  2. 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS):(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS:将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ,混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液,配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液: 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ,混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa): (#59329)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#59329,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度和稀释液)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (#7074,按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075,按 1:1000–1:3000 的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育,在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​时间 2005 年 6 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:10

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤(流式细胞术)

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。
  5. 建议使用抗兔二抗:
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者,细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时,向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度,使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离,以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗(按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备)中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光。
  8. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:404

特异性/灵敏度

ADORA2A/Adenosine Receptor A2a (E6M3W) Rabbit mAb 可识别 ADORA2A/Adenosine 受体 A2a 总蛋白的内源水平。在某些细胞系中检测到 80 kDa 处的弱未知条带。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 ADORA2A/腺苷受体 A2a 蛋白的 Ala405 周围残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

腺苷受体 A2a (A2AR) 是一种 G 蛋白偶联受体 (GPCR)。作为嘌呤能腺苷受体(A1、A2 和 A3)的一员,A2AR 会在结合腺苷时激活典型的 G 蛋白信号转导通路 (1)。腺苷存在于所有细胞和胞外液中。在生理和病理状态下,会通过 A2AR 调动腺苷信号转导。例如,腺苷通过 A2AR 调节神经元功能,起到微调神经元功能的作用 (2)。在某种程度上,A2AR 与多巴胺受体(D1 和 D3)和代谢型谷氨酸受体 (mGluR5) 等其他 GPCRs 形成功能性异二聚体的能力会调节 A2AR 功能 (3)。在脑中,A2AR 在基底神经节中富集,表明 A2AR 可能是帕金森病、药物成瘾和精神疾病等神经退行性疾病的一个潜在药物靶标 (4)。在脑外,A2AR 是维持免疫抑制性肿瘤微环境的一种免疫检查点分子,免疫抑制性肿瘤微环境是一个显示出腺苷水平相对升高的环境 (5,6)。
  1. Le, F. et al. (1996) Biochem Biophys Res Commun 223, 461-7.
  2. Sulli, G. et al. (2018) Trends Pharmacol Sci 39, 812-27.
  3. Verzijl, D. and Ijzerman, A.P. (2011) Purinergic Signal 7, 171-92.
  4. Bogenpohl, J.W. et al. (2012) J Comp Neurol 520, 570-89.
  5. Menzel, S. et al. (2018) Front Pharmacol 9, 266.
  6. Leone, R.D. et al. (2015) Comput Struct Biotechnol J 13, 265-72.

限制使用

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