查看特别推荐 >>
28692
5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
一抗
单克隆抗体
  1. 产品
  2. 一抗
  3. 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
R
重组

5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb #28692

引用 (34)
筛选器：
  1. IF
  2. DB
Immunofluorescence Image 1: 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
使用 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb（绿色）和 DYKDDDDK Tag (9A3) Mouse mAb #8146（红色），对转染表达带有 DYKDDDDK 标签的 TET1 催化结构域 (TET1-CD) 表达载体的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。正如预期的一样，表达 TET1-CD（红色）的 293T 细胞出现 5-甲基胞嘧啶（绿色）水平下降。
Dot Blot Image 1: 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
HCT 116 野生型 (WT) 和 DNMT1/DNMT3B 敲除 (KO) 细胞的 DNA 片段被印迹到尼龙膜上，经紫外线交联并使用 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb 进行检测。顶部小图显示了抗体可检测野生型细胞中更多甲基化的胞嘧啶，而底部小图则显示用亚甲蓝染色的膜。
Dot Blot Image 2: 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb 的特异性通过斑点印迹实验进行确定。仅使用未修饰的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC)、5-羧基胞嘧啶 (5-caC) 或 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC) 进行 PCR 可产生相同序列的 387 碱基对 DNA 片段。对应的 DNA 片段被印迹到尼龙膜上，经紫外线交联并使用 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb 进行检测。顶部小图显示抗体仅结合含 5-mC 的 DNA 片段，而底部小图则显示用亚甲蓝染色的膜。
Product Image 1: 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
使用1 μg NCCIT 细胞基因组 DNA 与 10 μl 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb #28692 或 10 μl Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (DIP Formulated) 进行 DNA 免疫沉淀。使用 human Aqp2 intron 5 primers、human TIMP3 promoter primers、SimpleDIP™ Human Testis-Specific H2B Promoter Primers 和 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量（等于 1）的信号进行表述。
Product Image 2: 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
使用1 μg 小鼠胚胎干细胞基因组 DNA 与 10 μl 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb #28692 或 10 μl Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (DIP Formulated) # 进行 DNA 免疫沉淀。使用 mouse Aqp2 exon 1 primers, SimpleDIP™ Mouse Intracisternal-A Particle (IAP) LTR Primers、mouse Lamc3 exon 1 primers 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量（等于 1）的信号进行表述。
Product Image 3: 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb 的特异性通过 ELISA 进行确定。使用含有未修饰的胞嘧啶或差异性修饰的胞嘧啶（5-mC、5-hmC、5-caC、5-fC）的单链 DNA 寡聚物滴定抗体。如图表所示，该抗体仅结合含 5-mC 的寡核苷酸。
Product Image 4: 5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb
5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb 的特异性通过 DNA 免疫沉淀进行确定。对用小鼠胚胎干细胞制备且加入含有未甲基化胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC) 或 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmc) 的对照 DNA 的基因组 DNA 进行 DNA 免疫沉淀。使用 5-MethylCytosine (5-MC) (D3S2Z) Rabbit mAb 进行 IPs。使用与内标的对照 DNA 序列特异的引物，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量（等于 1）的信号进行表述。
图像库
了解关于我们如何获得图像方面的更多信息
To Purchase # 28692S
目录# 规格 价格 库存
28692S		 100 µl

定制制剂

支持性数据

反应性 All
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:1600
DNA 点印迹 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。-20℃ 保存。切勿分装抗体。

实验步骤

打印

查看 > 收起 >

免疫荧光法（免疫细胞化学）

重要信息：该实验步骤采用非典型的固定和变性策略，仅某些靶标与之兼容。在适当的情况下，该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。

A. 溶液与试剂

    注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH2O 中，混匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 乙醇，70% 溶液，去离子化。
  3. 1.5 M 盐酸。
  4. 封闭液：购买即用型免疫荧光封闭液（#12411），或通过添加来自与第二抗体相同物种的 0.5 ml 正常血清（例如，正常山羊血清 (#5425)）和30 µl Triton ™ X-100 到 9.5 mL 1X PBS中来制备 1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100。4°C 保存。
  5. 抗体稀释缓冲液：购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液（#12378），或通过添加可0.1 g BSA（#9998）和 30 µl Triton ™ X-100 至10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100 缓冲液。4°C 保存。
  6. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。 单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定与透化

    注意：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。

  1. 抽吸介质，然后用冰冷的 70％ 乙醇覆盖标本（使用量足以完全覆盖 3-5 mm 的深度，请勿干燥）。
  2. 可固定 5 分钟。
  3. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 吸出 PBS，然后将固定的标本在 1.5 M HCl 中孵育 1 小时。
  5. 用 1X PBS 漂洗两次，每次 5 分钟。

C. 免疫染色

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
  3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。

  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

    6. 注意：如果使用荧光素偶联的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第8步。

  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。

  8. 适当的复染。

    9. 注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

  9. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
  10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。

发布​时间 2015 年 12 月

修订时间 2020 年 12 月

实验步骤编号：865

DNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

  1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液： 3.0 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 至 7.0。
  2. 10X SSc 缓冲液： 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
  3. 2X DNA 变性缓冲液： 200mM NaOH，20mM EDTA。
  4. 无核酸酶的水： (#12931)
  5. 印迹膜：本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
  6. 96 孔点印迹仪器
  7. 含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST)： (#9997) 为配制 1 L 1X TBST：将100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH20并混合。
  8. 脱脂奶粉： ( #9999)
  9. 封闭缓冲液： 含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
  12. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
  13. 检测试剂 LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注：本实验步骤针对使用 96 孔点印迹仪，将片段化、纯化的基因组 DNA（滴定 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 15.625 ng) 点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 DNA 的来源和类型，抗体检测所需的 DNA 数量不一。在开始之前：
•使用基因组 DNA 纯化实验步骤或试剂盒纯化基因组 DNA，并且超声处理基因组 DNA 以产生 200 和 500 bp 之间的片段。

可以通过含 100 bp DNA 标准品的 1% 琼脂糖凝胶电泳，分析 DNA 片段大小。

• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空，使其干燥。

  1. 将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液，并在95° C 孵育 10 分钟，使 DNA 变性。
  2. 添加200 μl 20X SSC 缓冲液，并且立即在冰上速冷 5 分钟。
  3. 添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl，DNA 浓度为 20 ng/μl。
  4. 使用步骤 3 中的 DNA 溶液，添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中，建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品，浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
  5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中，留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后，每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
  6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
  7. 在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

  1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜和一抗（按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂）在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜，同时温和振荡。
  4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  7. 继续进行检测（D 部分）。

D. DNA 的检测

  1. 将膜与 10 mL LumiGLO®（0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温孵育1 分钟，同时温和振荡。
  2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

注：由于检测反应的动力学，信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

发布​时间 2015 年 11 月

实验步骤编号：804

特异性/灵敏度

5-Methylcytosine (5-mC) (D3S2Z) Rabbit mAb 可识别内源水平的 5-甲基胞嘧啶。该抗体现已使用 ELISA、斑点印迹和 MeDIP 测定法进行了验证，并且表明对 5-甲基胞嘧啶有高特异性。

物种反应性：

预期的所有物种

来源/纯化

使用 5-甲基胞苷对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

DNA 在胞嘧啶残基的甲基化属于可遗传、表观遗传修饰，对正确调节基因表达、基因组印迹和哺乳动物发育至关重要 (1,2)。5-甲基胞嘧啶是通过两种酶 DNMT3a 和 DNMT3b从头确立的阻抑性表观遗传标记物，并且由 DNMT1 维持 (3, 4)。早先认为，5-甲基胞嘧啶在 DNA 复制期间被动耗尽。然而，后续研究已经证实 Ten-Eleven 转运 (TET) 蛋白 TET1、TET2、和 TET3 可以催化甲基化的胞嘧啶氧化成 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) (5)。此外，TET 蛋白还可以氧化 5-hmC 形成 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC) 和 5-羧基胞嘧啶 (5-caC)，二者均由胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶 (TDG) 切除，从而将胞嘧啶氧化与碱基切除修复通路有效联系，并且支持活跃的胞嘧啶去甲基化 (6,7)。
通常，DNA 甲基化以双模式方式发生，因此 CpG 二核苷酸主要在基因组内被甲基化，但与基因启动子相关的 CpG 富集序列的短延伸区（称为 CpG 岛）除外，这个区域几乎没有甲基化 (8)。癌细胞基因组通常总体被低甲基化，而 CpG 岛则被超甲基化，导致相关启动子受到抑制 (9)。有证据表明，在癌细胞中发现的大量异常超甲基化 CpG 岛存在于 RB1、MLH1 和 BRCA1 等抑癌基因中 (10)。
  1. Hermann, A. et al. (2004) Cell Mol Life Sci 61, 2571-87.
  2. Turek-Plewa, J. and Jagodziński, P.P. (2005) Cell Mol Biol Lett 10, 631-47.
  3. Okano, M. et al. (1999) Cell 99, 247-57.
  4. Li, E. et al. (1992) Cell 69, 915-26.
  5. Tahiliani, M. et al. (2009) Science 324, 930-5.
  6. He, Y.F. et al. (2011) Science 333, 1303-7.
  7. Ito, S. et al. (2011) Science 333, 1300-3.
  8. Suzuki, M.M. and Bird, A. (2008) Nat Rev Genet 9, 465-76.
  9. Berman, B.P. et al. (2012) Nat Genet 44, 40-6.
  10. Sproul, D. and Meehan, R.R. (2013) Brief Funct Genomics 12, 174-90.

限制使用

除非 CST 的合法授书代表以书面形式书行明确同意，否书以下条款适用于 CST、其关书方或分书商提供的书品。 任何书充本条款或与本条款不同的客书条款和条件，除非书 CST 的合法授书代表以书面形式书独接受， 否书均被拒书，并且无效。

专品专有“专供研究使用”的专专或专似的专专声明， 且未专得美国食品和专品管理局或其他外国或国内专管机专专专任何用途的批准、准专或专可。客专不得将任何专品用于任何专断或治专目的， 或以任何不符合专专声明的方式使用专品。CST 专售或专可的专品提供专作专最专用专的客专，且专用于研专用途。将专品用于专断、专防或治专目的， 或专专售（专独或作专专成）或其他商专目的而专专专品，均需要 CST 的专独专可。客专：(a) 不得专独或与其他材料专合向任何第三方出售、专可、 出借、捐专或以其他方式专专或提供任何专品，或使用专品制造任何商专专品，(b) 不得复制、修改、逆向工程、反专专、 反专专专品或以其他方式专专专专专品的基专专专或技专，或使用专品开专任何与 CST 的专品或服专专争的专品或服专， (c) 不得更改或专除专品上的任何商专、商品名称、徽专、专利或版专声明或专专，(d) 只能根据 CST 的专品专售条款和任何适用文档使用专品， (e) 专遵守客专与专品一起使用的任何第三方专品或服专的任何专可、服专条款或专似专专

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
SimpleChIP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
所有其他商标均属各自所有者专有。访问我们的商标信息页面。
Powered by Translations.com GlobalLink OneLink SoftwarePowered By OneLink