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51660
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb
一抗
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5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660

引用 (2)
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: 图像 1

使用 1 μg 小鼠胚胎干细胞基因组 DNA 与 10 μl 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 或 10 μl Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) # 进行 DNA 免疫沉淀。使用 mouse Aqp2 exon 1 primers、SimpleDIP™ Mouse Intracisternal-A Particle (IAP) LTR Primers、mouse Lamc3 exon 1 primers 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量（等于 1）的信号进行表述。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: 图像 2

使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb（绿色）和 DYKDDDDK Tag Antibody #2368（红色），对转染表达带有 DDK 标签的 TET1 催化结构域 (TET1-CD) 载体的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。正如预期的一样，表达 TET1-CD（红色）的 293T 细胞出现 5-羟甲基胞嘧啶（绿色）水平升高。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: 图像 3

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过斑点印迹实验进行确定。专门使用未修饰的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-羧基胞嘧啶 (5-caC) 或 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC)，通过 PCR 产生一个 387 碱基对 DNA 片段的相同序列。单独 DNA 片段被转移到尼龙膜上成为印迹，经紫外线交联并使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 进行检测。上小图显示抗体仅结合含 5-hmC 的 DNA 片段，而下小图则显示用亚甲蓝染色的膜。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: 图像 4

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 ELISA 进行确定。使用含有未修饰的胞嘧啶或差异性修饰的胞嘧啶（5-mC、5-hmC、5-caC、5-fC）的单链 DNA 寡聚物滴定抗体。如图表所示，该抗体仅结合含 5-hmC 的寡核苷酸。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: 图像 5

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 DNA 免疫沉淀进行确定。对用小鼠胚胎干细胞制备且加入含有未甲基化胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC) 或 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) 的 DNA 的基因组 DNA 进行 DNA 免疫沉淀。使用与内标的对照 DNA 序列特异的引物，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量（等于 1）的信号进行表述。

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支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源/亚型 小鼠 IgG1

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:400
DNA 点印迹 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液和试剂

注意：利用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

母液：

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 要制备 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中，混合均匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 乙醇，70% 溶液，去离子化。
  3. 1.5 M 盐酸。
  4. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS/1% BSA/ 0.3% Triton™X-100)：为配制 10 ml，将30 µl Triton™ X-100 和0.5mL 20X PBS 添加至 9.5mL dH2O。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。

  6. 建议使用荧光物质标记的 Anti-Mouse 二抗：

  7. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干培养基后用冷却的 70% 乙醇完全浸没细胞。
  2. 室温下固定细胞 5 分钟。
  3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 加入 1.5 M HCL 后在室温下孵育 30 分钟。
  5. 吸去 HCl 后用 1X PBS 洗两次，每次 5 分钟。
  6. 继续进行免疫染色 C 部分。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  8. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
  9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​于 2015 年 12 月 

实验步骤编号：865

DNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

  1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液： 3.0 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 至 7.0。
  2. 10X SSc 缓冲液： 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
  3. 2X DNA 变性缓冲液： 200mM NaOH，20mM EDTA。
  4. 无核酸酶的水： (#12931)
  5. 印迹膜：本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
  6. 96 孔点印迹仪器
  7. 含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST)： (#9997) 为配制 1 L 1X TBST：将100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH20并混合。
  8. 脱脂奶粉： ( #9999)
  9. 封闭缓冲液： 含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
  12. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
  13. 检测试剂 LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注：本实验步骤针对使用 96 孔点印迹仪，将片段化、纯化的基因组 DNA（滴定 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 15.625 ng) 点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 DNA 的来源和类型，抗体检测所需的 DNA 数量不一。在开始之前：
•使用基因组 DNA 纯化实验步骤或试剂盒纯化基因组 DNA，并且超声处理基因组 DNA 以产生 200 和 500 bp 之间的片段。

可以通过含 100 bp DNA 标准品的 1% 琼脂糖凝胶电泳，分析 DNA 片段大小。

• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空，使其干燥。

  1. 将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液，并在95° C 孵育 10 分钟，使 DNA 变性。
  2. 添加200 μl 20X SSC 缓冲液，并且立即在冰上速冷 5 分钟。
  3. 添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl，DNA 浓度为 20 ng/μl。
  4. 使用步骤 3 中的 DNA 溶液，添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中，建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品，浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
  5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中，留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后，每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
  6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
  7. 在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

  1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜和一抗（按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂）在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜，同时温和振荡。
  4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  7. 继续进行检测（D 部分）。

D. DNA 的检测

  1. 将膜与 10 mL LumiGLO®（0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温孵育1 分钟，同时温和振荡。
  2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

注：由于检测反应的动力学，信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

发布​于 2015 年 11 月 

实验步骤编号：804

特异性/敏感性

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 可识别内源水平的 5-hmC ；但许多细胞和组织包含低水平的 5-hmC，可能低于该抗体检测限。该抗体现已使用 ELISA、斑点印迹和 MeDIP 测定法进行了验证，并且表明对 5-hmC 有高特异性。

物种反应性：

预期的所有物种

来源/纯化

使用 5-羟甲基胞苷对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

DNA 在胞嘧啶残基的甲基化属于可遗传、表观遗传修饰，对正确调节基因表达、基因组印迹和哺乳动物发育至关重要 (1,2)。5-甲基胞嘧啶是通过两种酶 DNMT3a 和 DNMT3b从头确立的阻抑性表观遗传标记物，并且由 DNMT1 维持 (3, 4)。早先认为，5-甲基胞嘧啶在 DNA 复制期间被动耗尽。然而，后续研究已经证实 Ten-Eleven 转运 (TET) 蛋白 TET1、TET2、和 TET3 可以催化甲基化的胞嘧啶氧化成 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) (5)。此外，TET 蛋白还可以氧化 5-hmC 形成 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC) 和 5-羧基胞嘧啶 (5-caC)，二者均由胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶 (TDG) 切除，从而将胞嘧啶氧化与碱基切除修复通路有效联系，并且支持活跃的胞嘧啶去甲基化 (6,7)。

TET 蛋白介导的胞嘧啶羟甲基化最初在小鼠脑和胚胎干细胞中得到证实 (5, 8)。自此已经在许多组织中发现这种修饰作用，而脑中这种水平最高 (9)。尽管 5-fC 和 5-caC 似乎是短期中间体种类，但越来越多的证据显示， 5-hmC 是具有各种独特功能的不同表观遗传标记物 (10,11)。修饰的碱基本身在体内较稳定并且会与 MeCP2 等各种读取蛋白相互作用 (11,12)。在大脑发育期间，5-hmC 的总体水平升高，并且 5-hmC 在启动子区域和稳定增强子中富集。另外，在 5-hmC 水平和组蛋白 H3K9 水平与 H3K27 三甲基化水平之间存在反相关性，表明 5-hmC 在基因激活中发挥作用 (12)。在多种癌症（包括髓样白血病和黑色素瘤）中，已经报道 5-hmC 的含量较低 (13,14)。

  1. Hermann, A. et al. (2004) Cell Mol Life Sci 61, 2571-87.
  2. Turek-Plewa, J. and Jagodziński, P.P. (2005) Cell Mol Biol Lett 10, 631-47.
  3. Okano, M. et al. (1999) Cell 99, 247-57.
  4. Li, E. et al. (1992) Cell 69, 915-26.
  5. Tahiliani, M. et al. (2009) Science 324, 930-5.
  6. He, Y.F. et al. (2011) Science 333, 1303-7.
  7. Ito, S. et al. (2011) Science 333, 1300-3.
  8. Kriaucionis, S. and Heintz, N. (2009) Science 324, 929-30.
  9. Globisch, D. et al. (2010) PLoS One 5, e15367.
  10. Gao, Y. et al. (2013) Cell Stem Cell 12, 453-69.
  11. Mellén, M. et al. (2012) Cell 151, 1417-30.
  12. Wen, L. et al. (2014) Genome Biol 15, R49.
  13. Delhommeau, F. et al. (2009) N Engl J Med 360, 2289-301.
  14. Lian, C.G. et al. (2012) Cell 150, 1135-46.

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