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51660
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb
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5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660

引用 (2)
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: Image 1

使用 1 μg 小鼠胚胎干细胞基因组 DNA 与 10 μl 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 或 10 μl Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control (DIP Formulated) # 进行 DNA 免疫沉淀。使用 mouse Aqp2 exon 1 primers、SimpleDIP™ Mouse Intracisternal-A Particle (IAP) LTR Primers、mouse Lamc3 exon 1 primers 和 SimpleChIP® Mouse GAPDH Intron 2 Primers #8986，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量（等于 1）的信号进行表述。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: Image 2

使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb（绿色）和 DYKDDDDK Tag Antibody #2368（红色），对转染表达带有 DDK 标签的 TET1 催化结构域 (TET1-CD) 载体的 293T 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。正如预期的一样，表达 TET1-CD（红色）的 293T 细胞出现 5-羟甲基胞嘧啶（绿色）水平升高。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: Image 3

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过斑点印迹实验进行确定。专门使用未修饰的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-羧基胞嘧啶 (5-caC) 或 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC)，通过 PCR 产生一个 387 碱基对 DNA 片段的相同序列。单独 DNA 片段被转移到尼龙膜上成为印迹，经紫外线交联并使用 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 进行检测。上小图显示抗体仅结合含 5-hmC 的 DNA 片段，而下小图则显示用亚甲蓝染色的膜。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: Image 4

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 ELISA 进行确定。使用含有未修饰的胞嘧啶或差异性修饰的胞嘧啶（5-mC、5-hmC、5-caC、5-fC）的单链 DNA 寡聚物滴定抗体。如图表所示，该抗体仅结合含 5-hmC 的寡核苷酸。

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb: Image 5

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 的特异性通过 DNA 免疫沉淀进行确定。对用小鼠胚胎干细胞制备且加入含有未甲基化胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶 (5-mC) 或 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) 的 DNA 的基因组 DNA 进行 DNA 免疫沉淀。使用与内标的对照 DNA 序列特异的引物，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。每种样品中免疫沉淀的 DNA 的量以相对于输入 DNA 总量（等于 1）的信号进行表述。

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支持数据

反应性 所有物种
敏感性 内源性
MW (kDa)
来源/亚型 小鼠 IgG1

应用缩写：

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:400
DNA 点印迹 1:1000

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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免疫荧光法（免疫细胞化学）

重要信息：该实验步骤采用非典型的固定和变性策略，仅某些靶标与之兼容。在适当的情况下，该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。

A. 溶液和试剂

    注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH2O 中，混匀。调节 pH 至 8.0。
  2. 乙醇，70% 溶液，去离子化。
  3. 1.5 M 盐酸。
  4. 封闭液：购买即用型免疫荧光封闭液（#12411），或通过添加来自与第二抗体相同物种的 0.5 ml 正常血清（例如，正常山羊血清 (#5425)）和30 µl Triton ™ X-100 到 9.5 mL 1X PBS中来制备 1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100。储存在 4°C。
  5. 抗体稀释缓冲液：购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液（#12378），或通过添加可0.1 g BSA（#9998）和 30 µl Triton ™ X-100 至10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100 缓冲液。储存在 4°C。
  6. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。 单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定和通透

    注意：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。

  1. 抽吸介质，然后用冰冷的 70％ 乙醇覆盖标本（使用量足以完全覆盖 3-5 mm 的深度，请勿干燥）。
  2. 可固定 5 分钟。
  3. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 吸出 PBS，然后将固定的标本在 1.5 M HCl 中孵育 1 小时。
  5. 用 1X PBS 漂洗两次，每次 5 分钟。

C. 免疫染色

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
  3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。

  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

    6. 注意8：如果使用荧光素偶联的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第 步。

  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。

  8. 适当的复染。

    9. 注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

  9. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
  10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。

发布​于 2015 年 12 月 

修订于 2020 年 12 月

实验步骤编号：865

DNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

  1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液： 3.0 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 至 7.0。
  2. 10X SSc 缓冲液： 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
  3. 2X DNA 变性缓冲液： 200mM NaOH，20mM EDTA。
  4. 无核酸酶的水： (#12931)
  5. 印迹膜：本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
  6. 96 孔点印迹仪器
  7. 含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST)： (#9997) 为配制 1 L 1X TBST：将100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH20并混合。
  8. 脱脂奶粉： ( #9999)
  9. 封闭缓冲液： 含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
  12. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
  13. 检测试剂 LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注：本实验步骤针对使用 96 孔点印迹仪，将片段化、纯化的基因组 DNA（滴定 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 15.625 ng) 点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 DNA 的来源和类型，抗体检测所需的 DNA 数量不一。在开始之前：
•使用基因组 DNA 纯化实验步骤或试剂盒纯化基因组 DNA，并且超声处理基因组 DNA 以产生 200 和 500 bp 之间的片段。

可以通过含 100 bp DNA 标准品的 1% 琼脂糖凝胶电泳，分析 DNA 片段大小。

• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空，使其干燥。

  1. 将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液，并在95° C 孵育 10 分钟，使 DNA 变性。
  2. 添加200 μl 20X SSC 缓冲液，并且立即在冰上速冷 5 分钟。
  3. 添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl，DNA 浓度为 20 ng/μl。
  4. 使用步骤 3 中的 DNA 溶液，添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中，建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品，浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
  5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中，留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后，每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
  6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
  7. 在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

  1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜和一抗（按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂）在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜，同时温和振荡。
  4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
  6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  7. 继续进行检测（D 部分）。

D. DNA 的检测

  1. 将膜与 10 mL LumiGLO®（0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温孵育1 分钟，同时温和振荡。
  2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

注：由于检测反应的动力学，信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

发布​于 2015 年 11 月 

实验步骤编号：804

特异性/敏感性

5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb 可识别内源水平的 5-hmC ；但许多细胞和组织包含低水平的 5-hmC，可能低于该抗体检测限。该抗体现已使用 ELISA、斑点印迹和 MeDIP 测定法进行了验证，并且表明对 5-hmC 有高特异性。

物种反应性：

预期的所有物种

来源/纯化

使用 5-羟甲基胞苷对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

DNA 在胞嘧啶残基的甲基化属于可遗传、表观遗传修饰，对正确调节基因表达、基因组印迹和哺乳动物发育至关重要 (1,2)。5-甲基胞嘧啶是通过两种酶 DNMT3a 和 DNMT3b从头确立的阻抑性表观遗传标记物，并且由 DNMT1 维持 (3, 4)。早先认为，5-甲基胞嘧啶在 DNA 复制期间被动耗尽。然而，后续研究已经证实 Ten-Eleven 转运 (TET) 蛋白 TET1、TET2、和 TET3 可以催化甲基化的胞嘧啶氧化成 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC) (5)。此外，TET 蛋白还可以氧化 5-hmC 形成 5-甲酰基胞嘧啶 (5-fC) 和 5-羧基胞嘧啶 (5-caC)，二者均由胸腺嘧啶-DNA 糖基化酶 (TDG) 切除，从而将胞嘧啶氧化与碱基切除修复通路有效联系，并且支持活跃的胞嘧啶去甲基化 (6,7)。

TET 蛋白介导的胞嘧啶羟甲基化最初在小鼠脑和胚胎干细胞中得到证实 (5, 8)。自此已经在许多组织中发现这种修饰作用，而脑中这种水平最高 (9)。尽管 5-fC 和 5-caC 似乎是短期中间体种类，但越来越多的证据显示， 5-hmC 是具有各种独特功能的不同表观遗传标记物 (10,11)。修饰的碱基本身在体内较稳定并且会与 MeCP2 等各种读取蛋白相互作用 (11,12)。在大脑发育期间，5-hmC 的总体水平升高，并且 5-hmC 在启动子区域和稳定增强子中富集。另外，在 5-hmC 水平和组蛋白 H3K9 水平与 H3K27 三甲基化水平之间存在反相关性，表明 5-hmC 在基因激活中发挥作用 (12)。在多种癌症（包括髓样白血病和黑色素瘤）中，已经报道 5-hmC 的含量较低 (13,14)。

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  2. Turek-Plewa, J. and Jagodziński, P.P. (2005) Cell Mol Biol Lett 10, 631-47.
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