免疫荧光法(免疫细胞化学)
重要信息:该实验步骤采用非典型的固定和变性策略,仅某些靶标与之兼容。在适当的情况下,该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。
A. 溶液与试剂
注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。
- 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS):要配制 1 L 1X PBS:添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH2O 中,混匀。调节 pH 至 8.0。
- 乙醇,70% 溶液,去离子化。
- 1.5 M 盐酸。
- 封闭液:购买即用型免疫荧光封闭液(#12411),或通过添加来自与第二抗体相同物种的 0.5 ml 正常血清(例如,正常山羊血清 (#5425))和30 µl Triton ™ X-100 到 9.5 mL 1X PBS中来制备 1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100。4°C 保存。
- 抗体稀释缓冲液:购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液(#12378),或通过添加可0.1 g BSA(#9998)和 30 µl Triton ™ X-100 至10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100 缓冲液。4°C 保存。
- 荧光素偶联的二抗:使用对您的一抗宿主物种(例如兔子)具有反应性的二抗。 单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。
B. 固定与透化
注意:所有后续孵育都应在室温(20-25°C)下进行, 除非另有说明。
- 抽吸介质,然后用冰冷的 70% 乙醇覆盖标本(使用量足以完全覆盖 3-5 mm 的深度,请勿干燥)。
- 可固定 5 分钟。
- 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
- 吸出 PBS,然后将固定的标本在 1.5 M HCl 中孵育 1 小时。
- 用 1X PBS 漂洗两次,每次 5 分钟。
C. 免疫染色
- 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
- 封闭时,在抗体稀释缓冲液中制备一抗(建议的稀释范围请参见产品网站)。
- 吸出封闭溶液,然后加入稀释后的一抗。
- 4°C 孵育过夜。
用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
注意:如果使用荧光素偶联的一抗,则跳转到 C部分,第8步。
- 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后,避光孵育标本 1–2 小时。
- 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟,使其避光。
适当的复染。
注意:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括 DNA 染料等)时,请参考染料产品页,了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。
- 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
- 为了长期保存,请在 4°C 下避光保存样品。
发布时间 2015 年 12 月
修订时间 2020 年 12 月
实验步骤编号:865
DNA 点印迹实验步骤
A. 缓冲液和试剂
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20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液: 3.0 M NaCl,0.3 M 柠檬酸钠,pH 至 7.0。
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10X SSc 缓冲液: 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
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2X DNA 变性缓冲液: 200mM NaOH,20mM EDTA。
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无核酸酶的水: (#12931)
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印迹膜:本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
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96 孔点印迹仪器
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含 Tween® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST): (#9997) 为配制 1 L 1X TBST:将100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH20并混合。
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脱脂奶粉: ( #9999)
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封闭缓冲液: 含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;对于 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
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牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)
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一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;对于 20 ml,将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
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HRP 偶联二抗:抗兔 (#7074);抗小鼠 (#7076)。
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检测试剂 LumiGLO®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。
B. 点印迹
注:本实验步骤针对使用 96 孔点印迹仪,将片段化、纯化的基因组 DNA(滴定 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 15.625 ng) 点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 DNA 的来源和类型,抗体检测所需的 DNA 数量不一。在开始之前:
•使用基因组 DNA 纯化实验步骤或试剂盒纯化基因组 DNA,并且超声处理基因组 DNA 以产生 200 和 500 bp 之间的片段。
可以通过含 100 bp DNA 标准品的 1% 琼脂糖凝胶电泳,分析 DNA 片段大小。
• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空,使其干燥。
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将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液,并在95° C 孵育 10 分钟,使 DNA 变性。
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添加200 μl 20X SSC 缓冲液,并且立即在冰上速冷 5 分钟。
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添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl,DNA 浓度为 20 ng/μl。
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使用步骤 3 中的 DNA 溶液,添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中,建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品,浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
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从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中,留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后,每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
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从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
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在 1200 J/m2处将尼龙膜 UV 交联。
C. 膜封闭和抗体孵育
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将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时,同时温和振荡。
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将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
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将膜和一抗(按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂)在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜,同时温和振荡。
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用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
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将膜与合适的 HRP 偶联二抗(#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时,同时温和振荡。
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将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
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继续进行检测(D 部分)。
D. DNA 的检测
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将膜与 10 mL LumiGLO®(0.5 ml 20x LumiGLO® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水)或 10 ml SignalFire™ #6883(5 ml 试剂 A,5 ml 试剂 B)在室温孵育1 分钟,同时温和振荡。
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将膜上多余的显影液沥干(勿令其干燥),包裹在塑料膜中,然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。
注:由于检测反应的动力学,信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。
实验步骤编号:804