5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) (HMC31) Mouse mAb #51660

免疫荧光法（免疫细胞化学）

重要信息：该实验步骤采用非典型的固定和变性策略，仅某些靶标与之兼容。在适当的情况下，该实验步骤将在特定于产品的网页上的“产品信息”横幅下链接至其经过验证的抗体。

A. 溶液与试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH₂O 中，混匀。调节 pH 至 8.0。
2. 乙醇，70% 溶液，去离子化。
3. 1.5 M 盐酸。
4. 封闭液：购买即用型免疫荧光封闭液（#12411），或通过添加来自与第二抗体相同物种的 0.5 ml 正常血清（例如，正常山羊血清 (#5425)）和30 µl Triton ^™ X-100 到 9.5 mL 1X PBS中来制备 1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton^™ X-100。4°C 保存。
5. 抗体稀释缓冲液：购买即用型免疫荧光抗体稀释缓冲液（#12378），或通过添加可0.1 g BSA（#9998）和 30 µl Triton ^™ X-100 至10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton^™ X-100 缓冲液。4°C 保存。
6. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。 单击此处获得批准用于免疫荧光法的二抗列表。

B. 固定与透化

注意：所有后续孵育都应在室温（20-25°C）下进行， 除非另有说明。

1. 抽吸介质，然后用冰冷的 70％ 乙醇覆盖标本（使用量足以完全覆盖 3-5 mm 的深度，请勿干燥）。
2. 可固定 5 分钟。
3. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 吸出 PBS，然后将固定的标本在 1.5 M HCl 中孵育 1 小时。
5. 用 1X PBS 漂洗两次，每次 5 分钟。

C. 免疫染色

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭时，在抗体稀释缓冲液中制备一抗（建议的稀释范围请参见产品网站）。
3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。

5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

注意：如果使用荧光素偶联的一抗，则跳转到 Ｃ部分，第8步。

6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1–2 小时。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。

8. 适当的复染。

注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括 DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。查看我们的经验证用于免疫荧光分析的细胞染料列表。

9. 在适当的抗荧光衰减试剂如 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或含 DAPI 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#8961)中封片。
10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。

DNA 点印迹实验步骤

A. 缓冲液和试剂

1. 20X 柠檬酸钠盐水 (SSC) 缓冲液： 3.0 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，pH 至 7.0。
2. 10X SSc 缓冲液： 1:2 稀释 20X SSC 缓冲液。
3. 2X DNA 变性缓冲液： 200mM NaOH，20mM EDTA。
4. 无核酸酶的水： (#12931)
5. 印迹膜：本实验步骤已针对带正电荷的尼龙膜进行优化。
6. 96 孔点印迹仪器
7. 含 Tween^® 20 的 10X Tris 盐缓冲液 (TBST)： (#9997) 为配制 1 L 1X TBST：将100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH20并混合。
8. 脱脂奶粉： ( #9999)
9. 封闭缓冲液： 含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)
11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加至 20 ml 1X TBST 并充分混合。
12. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
13. 检测试剂 LumiGLO^®化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 点印迹

注：本实验步骤针对使用 96 孔点印迹仪，将片段化、纯化的基因组 DNA（滴定 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng 和 15.625 ng) 点样到带正电荷的尼龙膜上。根据 DNA 的来源和类型，抗体检测所需的 DNA 数量不一。在开始之前：
•使用基因组 DNA 纯化实验步骤或试剂盒纯化基因组 DNA，并且超声处理基因组 DNA 以产生 200 和 500 bp 之间的片段。

可以通过含 100 bp DNA 标准品的 1% 琼脂糖凝胶电泳，分析 DNA 片段大小。

• 将一片尼龙膜切割成点印迹多管吸印仪的尺寸。• 用 10x SSc 缓冲液润湿尼龙膜。• 通过在 96 孔点印迹仪中放置尼龙膜并施加真空，使其干燥。

1. 将片段化的基因组 DNA 在 100 ul 无核酸酶的水中稀释成 100ng/μl。随后添加 100 μl 2X DNA 变性缓冲液，并在95° C 孵育 10 分钟，使 DNA 变性。
2. 添加200 μl 20X SSC 缓冲液，并且立即在冰上速冷 5 分钟。
3. 添加100 μl 无核酸酶的水以补足 DNA 溶液至终体积 500 μl，DNA 浓度为 20 ng/μl。
4. 使用步骤 3 中的 DNA 溶液，添加 250 μl DNA 溶液至 250 μl 无核酸酶的水中，建立六份 2 倍连续稀释物。这将产生 7 份250 μl DNA的 DNA 样品，浓度分别为 20 ng/μl、10 ng/μl、5 ng/μl、2.5 ng/μl、1.25 ng/μl、0.625 ng/μl 和0.3125 ng/μl。
5. 从 7 份稀释物样品中各取 50 μl 至 96 孔点印迹仪的单个孔中，留下最后一孔添加无核酸酶的水。随后，每个孔的 DNA 添加量应分别为 1000 ng、500 ng、250 ng、125 ng、62.5 ng、31.25 ng、15.625 ng 和0 ng。施加柔和真空压力以将溶液过膜引出。尼龙膜在 步骤6 之前应几乎全干。
6. 从 96 孔点印迹仪取下尼龙膜并且包裹在保鲜膜中。
7. 在 1200 J/m²处将尼龙膜 UV 交联。

C. 膜封闭和抗体孵育

1. 将膜在室温于 25 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
2. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 将膜和一抗（按照抗体产品数据表中建议的适当稀释度和稀释剂）在4°C 于 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育过夜，同时温和振荡。
4. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
5. 将膜与合适的 HRP 偶联二抗（#7074 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 或 #7076 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）按 1:2000 在室温于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时，同时温和振荡。
6. 将膜用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
7. 继续进行检测（D 部分）。

D. DNA 的检测

1. 将膜与 10 mL LumiGLO^®（0.5 ml 20x LumiGLO^® #7003、0.5 ml 20x 过氧化物和 9.0 ml 净化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）在室温孵育1 分钟，同时温和振荡。
2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。从刚开始的 10 秒曝光结果中可以看出适当的曝光时间。

注：由于检测反应的动力学，信号在孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。