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7881
PathScan® Total β-Actin Sandwich ELISA Antibody Pair
ELISA 试剂盒
ELISA Antibody Pair

PathScan® Total β-Actin Sandwich ELISA Antibody Pair #7881

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PathScan® Total β-Actin Sandwich ELISA Antibody Pair: Image 1

图 1. Hela 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® Total β-Actin Sandwich ELISA Antibody Pair 时在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。

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7881S
1 个试剂盒(试剂可用于 4 x 96 孔板)

重要订购明细

客户订购明细: 产品订购后组配。请为订单处理时间预留三个工作日。

支持数据

反应性 H M R Hm Mk

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 盖颜色
β-Actin Capture Rabbit mAb (100X) 400 µl 粉色
Pan-Actin Detection Mouse mAb (100X) 400 µl 蓝色
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (1000X) 40 µl 黄色

保存

捕获和检测抗体存储在 4ºC。HRP 标记二抗保存在 -20°C 下。

实验步骤

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ELISA Antibody Pair

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 洗涤缓冲液:1X PBS/0.05% Tween® 20、(20X PBST #9809)。
  3. 封闭缓冲液:1X PBS/0.05% Tween® 20、1% BSA。
  4. 1X 细胞裂解缓冲液:10X 细胞裂解缓冲液 (#9803):要配制 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液,则添加 10X 细胞裂解缓冲液到 9 ml dH2O 中,混匀。这种缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。

    建议:使用前,立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (#8553)。

  5. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  6. TMB 底物:(#7004)。
  7. STOP 溶液:(#7002)

    注意:试剂应每天新鲜制备。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1,200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1,200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基收获的细胞可以在含 1 mM PMSF 的 2.0 ml 1 X 细胞裂解缓冲液中裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性使用分装量贮存在 -80°C。

C. 包被程序

  1. 用 200 µl dH2O 淋洗微量平板,弃去液体。在纸巾上蘸干以确保各孔干燥。
  2. 在 1 X PBS 中 1:100 稀释捕获抗体。对于单块 96 孔板,添加 100 µl 捕获抗体母液至 9.9 ml 1 X PBS。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 4°C 孵育过夜(17–20 小时)。
  3. 在过夜包被后,轻柔地揭开平板的盖子,并洗涤各孔
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用洗涤缓冲液洗涤 4 次,每次 200 µl/孔。每次洗涤的时候都要将平板拍在未用过的纸巾上,拍击力度要足够大,这样才能清除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让孔处于完全干燥的状态。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  4. 封闭平板。添加 150 µl 封闭缓冲液/孔,盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  5. 在封闭后,洗涤平板(C 部分,步骤 3)。平板可直接使用。

D. 检测程序

  1. 裂解物可以不稀释使用或在封闭缓冲液中稀释使用。每孔添加 100 µl 裂解物。盖住平板并在 37°C 孵育 2 小时。
  2. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  3. 在封闭缓冲液中 1:100 稀释检测抗体。对于单块 96 孔板,添加100 µl 检测抗体母液至 9.9 ml 封闭缓冲液中。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 1 小时。
  4. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  5. 将二抗,即链霉亲和素抗小鼠或抗兔-HRP,在封闭缓冲液中 1: 1000 稀释。对于单块 96 孔板,添加 10 µl 二抗母液至 9.99 ml封闭缓冲液。充分混合并添加 100 µl/孔。盖住平板并在 37°C 孵育 30 分钟。
  6. 洗涤平板(C 部分,步骤 3)。
  7. 向每个孔中添加 100 µl TMB Substrate。盖住平板并在 37°C 孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔中添加 100 µl STOP Solution。温和振摇数秒。
  9. 在微量平板读数仪上在 450 nm 吸光度读取平板。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。在添加 STOP Solution 后 30 分钟内在 450 nm 读取吸光度。

发布​于 2008 年 1 月 

修订于 2013 年 9 月

实验步骤编号:20

产品说明

CST 的 PathScan® Total β-Actin Sandwich ELISA Antibody Pair 是 PathScan® Total β-Actin Sandwich ELISA Kit #7880 的一种经济合算的替代物。捕获和检测抗体以及 HRP 标记二抗分别作为 100X 原液和 1000X 原液提供。提供的试剂足以进行 4 x 96 孔的 ELISA 测定。β-actin rabbit capture antibody 在 96 孔的微孔板中 PBS 包被过夜。封闭后,加入细胞裂解物,再加入 pan-actin mouse detection antibody 和 HRP-linked, anti-mouse IgG antibody。随后加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。该显色的吸光度值与 β-肌动蛋白的数量成比例。

该试剂盒中的抗体为该试剂盒所特制。

特异性/敏感性

如需了解抗体对的特异性和敏感度,请参阅相应的 PathScan® Sandwich ELISA Kit。注意:经内部测试确定,该抗体对可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 仓鼠 , 猴

背景

作为一种普遍表达的真核蛋白,肌动蛋白是细胞骨架的一种主要组分。哺乳动物至少有 6 种已知的同工型。非肌肉 β 和 γ 肌动蛋白(也称细胞浆肌动蛋白)主要在非肌肉细胞中表达,可控制细胞结构和运动 (1)。所有肌动蛋白同工型都是高度同源的,细胞质 β- 和 γ 肌动蛋白序列仅因四种生化类似的氨基酸而异 (2)。因此,升高至 β 肌动蛋白的抗体可能与 γ 肌动蛋白发生交叉反应,反之亦然。α-心脏和 α 骨骼肌动蛋白在带状心脏和骨骼肌中表达,分别分别;两个平滑肌肉女演员,α- 和 γ-肌动蛋白,主要发现在血管平滑肌肉和肠道平滑肌肉中,。这些肌蛋白同工型可调节肌肉细胞收缩能力 (1)。肌动蛋白主要作为一种纤维聚合物纤丝状肌动蛋白而存在。在一些进程(如胞质分裂、内吞或应激)中,在细胞骨架重组信号的刺激下,丝切蛋白促进纤丝状肌动蛋白的片段化和解聚合导致单体球状形式球型肌动蛋白的增加 (3)。Arp2/3 复合体可稳定纤丝状肌动蛋白片段,并促进新肌动蛋白丝的形成 (3)。研究表明,肌动蛋白在原发性乳腺癌中被过度磷酸化 (4)。研究也表明,已经在体外、心肌和骨骼肌中观察到凋亡条件下的肌动蛋白的剪切 (5-7)。被 caspase-3 剪切的肌动蛋白,会加速泛素/蛋白酶体依赖的肌肉蛋白水解 (7)。

  1. Herman, I.M. (1993) Curr Opin Cell Biol 5, 48-55.
  2. Perrin, B.J. and Ervasti, J.M. (2010) Cytoskeleton (Hoboken) 67, 630-4.
  3. Condeelis, J. (2001) Trends Cell Biol 11, 288-93.
  4. Lim, Y.P. et al. (2004) Clin Cancer Res 10, 3980-7.
  5. Kayalar, C. et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2234-8.
  6. Communal, C. et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 6252-6.
  7. Du, J. et al. (2004) J Clin Invest 113, 115-23.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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