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7046
PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit
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PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit #7046

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PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit: Image 1
图 1：A-673 细胞用胰岛素处理会刺激Akt2在Ser474位点的磷酸化，可使用 PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit #7048 进行检测，但不影响 PathScan® Total Akt2 Sadwich ELISA Kit #7046 检测Akt2 总蛋白的水平。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示，使用 Akt2 (5B5) Rabbit mAb #2964（左小图）和 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（右小图）的相应蛋白质印迹如底部图所示。
PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit: Image 2
图 2：使用重组 Akt1、Akt2 和 Akt3 蛋白可识别 total Akt2 sandwich ELISA kit 的特异性。PathScan® Total Akt1 Sandwich ELISA Kit #7170 可检测总 Akt1，而 PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit 则可检测总 Akt2 的水平。使用两种 ELISA 试剂盒可识别重组失活的 Akt 蛋白（每个微孔 1.0 ng）。
PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit: Image 3
图 3：未经处理和已经胰岛素处理的 A-673 细胞的裂解物蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。饥饿后，A-673 细胞（75% 融合度）在 37ºC 下用胰岛素 (100 nM) 处理 10­20 分钟后进行裂解。
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7046C		 1 个试剂盒（96 次检测）

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支持性数据

反应性 H M

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
Akt Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Akt2 Mouse Detection mAb 1 个 绿色（冻干）
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色（冻干）
Detection Antibody Diluent 2 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

产品说明

CST 的 PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒，能检测 Akt2 蛋白的内源水平。Akt rabbit antibody 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后，该包被抗体可捕获 Akt 蛋白（磷酸和非磷酸形式）。充分洗涤后，加入 Akt2 mouse mAb 来检测捕获的 Akt2 蛋白。随后使用 HRP 标记的抗小鼠 IgG 来检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 TMB 来显色。该显色的吸光度值与 Akt2 蛋白的数量成比例。

*试剂盒中的抗体为专属该试剂盒的定制制剂。

实验步骤

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ELISA 比色法（冻干）

A. 溶液与试剂

注意：用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条：使用前，将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体：以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂（绿色溶液）以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。如需配制最终使用溶液，则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中，轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *：以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂（红色溶液）以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。如需配制最终使用溶液，则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中，轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂：绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体（提供 11 ml）。
  5. HRP 稀释剂：红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody（提供 11 ml）。
  6. 样品稀释剂：蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液：用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液（包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中）来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液：10X 细胞裂解缓冲液 #9803：该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用（1-2 周）。建议：使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意：一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心（约 1200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后，掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封，并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂（包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中，蓝色）稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外，也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时，将平板重重拍在未用过的毛巾上，以便去除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体（绿色）（参阅 A 部分，步骤 2）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗（红色）（参阅 A 部分，步骤 3）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 10 分钟，或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​时间 2013 年 11 月

实验步骤编号：204

特异性/灵敏度

CST 的 PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA Kit 可检测人 (A-673) 细胞中内源水平的 Akt2 蛋白，如图 1 所示。Total Akt2 kit 的特异性如图 2 所示，该试剂盒的敏感性如图 3 所示。经内部测试确定，该试剂盒可检测规定物种中的蛋白，但也可能检测其他物种的同源蛋白。

背景

Akt 也称作 PKB 或 Rac，在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活，并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ，以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的 PDK2 可在 Ser473 处磷酸化 Akt ，它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标（包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和 caspase-9）而抑制凋亡，进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外，Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和周期蛋白 D1 降解 (14) 并通过负向调节周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16) 来参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR，在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要地，Akt 使结节蛋白 (TSC2)（ mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制物）磷酸化并失活(18,19)。

  1. Franke, T.F. et al. (1997) Cell 88, 435-7.
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  6. Jacinto, E. et al. (2006) Cell 127, 125-37.
  7. Cardone, M.H. et al. (1998) Science 282, 1318-21.
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  17. Navé, B.T. et al. (1999) Biochem J 344 Pt 2, 427-31.
  18. Inoki, K. et al. (2002) Nat Cell Biol 4, 648-57.
  19. Manning, B.D. et al. (2002) Mol Cell 10, 151-62.

通路

探索与本品相关的通路。

限制使用

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仅供研究使用。不得用于诊断程序。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
PathScan 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
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