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69486
SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit
ELISA 试剂盒
ELISA 试剂盒

SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit #69486

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SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit: Image 1

图 1. 患者检测:使用 SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit #69486 对患者样品进行了测试。如实验步骤中所述,在运行检测之前将血清/血浆样品加热灭活(56°C,30 分钟)并以 1:10 的比例稀释。针对各血清/血浆样品绘制了 SARS-CoV-2 spike RBD-ACE2 相互作用的抑制百分比(抑制百分比),与来自诊断为 SARS-CoV-2(诊断阳性,n=11*)的供体的样品相对应的值绘制于左侧,与来自 SARS-CoV-2 爆发之前收集的假定未感染供体(假定阴性,n=9)的样品相对应的值绘制于右侧。根据试剂盒实验步骤“数据分析”部分所述的 20% 抑制截止标准(虚线),样品被认为是 SARS-CoV-2 阻断抗体阳性或阴性。

*阳性参比样本来自患有阳性 SARS-CoV-2 诊断的患者供体。但是,SARS-CoV-2 阳性诊断并不总是与阻断抗体的存在相关,因为疾病严重程度,相对于疾病发作的样品采集时间以及患者状况的差异可能会影响参考样品中抗体的存在和丰度,从而阻止 SARS-CoV-2 spike RBD 和 ACE2 之间的相互作用。

注: 我们将继续检测更多样品(如可用)。如需获取最新数据集,请始终参考网站产品页面上的 #69486。

SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit: Image 2

板内准确度:使用一个 SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit #69486 测定试剂盒,分别对三个不同的血清样品进行 16 复孔测试。计算每个样品的测定内 CV (%),并且使用所附实验步骤中所述的临界标准与仅 RBD-HRP 的对照物相比时,每个复孔样品都被正确地标识为阳性或阴性。

SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit: Image 3

板间准确度:使用 3 个不同血清样品设置复孔,阳性和阴性对照设立复孔,在同一批次的五个测定试剂盒中检测。计算每个样品的分析间 CV (%),并且使用所附实验步骤中所述的临界标准与仅 RBD-HRP 的对照物相比时,每个测定试剂盒均正确地将样品鉴定为阳性或阴性。

购买 # 69486C
产品货号 规格 价格 库存
69486C
1 个试剂盒(96 次检测)

支持数据

反应性

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
ACE2 Protein Coated Microwells 96 次测试
SARS-CoV-2 Spike RBD Protein, HRP-linked 1 个 红色(冻干)
Sample Diluent A 25 ml
HRP Diluent 11 ml 红色
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Kit #69486 Positive Control 1 个
ELISA Kit #69486 Negative Control 1 个

产品说明

SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit(或小分子),这些抗体阻断 SARS-CoV-2 刺突蛋白的宿主受体结合域(RBD)与 ACE2。在此测试中,将与 HRP(RBD-HRP)连接的 SARS-CoV-2 spike RBD 与样品和对照物进行预孵育,从而使样品中存在的封闭抗体与 RBD-HRP 结合。然后将这些预孵育的混合物添加到包被 ACE2 蛋白的微孔板中。取决于每个样品中存在的阻断活性,ACE2 会以不同程度捕获 RBD-HRP。然后洗涤微孔以除去未结合的物质。加入 HRP 底物 (TMB) 来显色。此显影颜色的光密度大小与样品阻断 SARS-CoV-2 刺突 RBD 和 ACE2 蛋白之间相互作用的能力成反比。例如,如果样品中不存在阻断活性,则 RBD-HRP 将能够与微孔板上的 ACE2 结合,从而产生高信号。相反,具有高封闭活性的样品将阻止 RBD-HRP 与微孔板上的 ACE2 结合,从而导致信号低。该试剂盒旨在检测人血清/血浆样品中存在的封闭抗体。但是,该试剂盒还可用于评估非人类抗体和小分子的阻断活性。在后一种情况下(对于非人类抗体和小分子),用户将必须确定要使用的样品的适当稀释/浓度以及运行适当的对照物。

实验步骤

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SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA 试剂盒

此试剂盒仅供研究使用。不得用于诊断或临床流程。

A. 溶液和试剂

注意:用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。仅制备实验当天所需的足够试剂。

  1. ACE2 蛋白包被的微孔:在打开袋子/使用之前,将其全部恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
  2. 1X ELISA 洗涤缓冲液:通过使用去离子水稀释 ELISA 洗涤缓冲液 (20X)(每个试剂盒中均有提供)至 1X 来制备。
  3. 样品稀释剂 A:提供的稀释剂用于稀释样品以及复溶试剂盒中包括的阳性和阴性对照。
  4. HRP 稀释剂:提供红色稀释剂,用于重组和稀释 HRP 连接的 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白(提供 11.0 mL,仅需要 8.0 mL)。
  5. 与 HRP 链接的 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白:冻干后为红色蛋糕状或粉末。加入 1.0 mL HRP 稀释剂以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 mL 重新配制的 HRP 链接的蛋白到 7.0 mL HRP 稀释剂中,轻轻混合。不要涡旋 HRP 链接的蛋白,因为这可能会对它的性能产生不利影响。为获得最佳结果,立即使用此工作液。未使用的工作液可能在 4°C 下储存最多 4 周,但与新制溶液相比可能会有一些信号损失。
  6. 阳性对照:用 1.0 mL 样品稀释液 A 复溶冻干的阳性对照小瓶。轻轻充分混合,在室温下保持 1 分钟,然后按照“检测程序”部分中所述的步骤进行操作。建议在复溶后立即使用阳性对照,但剩余物质可在 4°C 下储存最多 4 周(与新鲜制备的溶液相比,阳性对照的阻断活性可能会有所降低)。阳性对照作为一种对照试剂提供,而不是作为一种绝对定量方法。
  7. 阴性对照:用 1.0 mL 样品稀释液 A 复溶冻干的阴性对照小瓶。轻轻充分混合,在室温下保持 1 分钟,然后按照“检测程序”部分中所述的步骤进行操作。建议在复溶后立即使用阴性对照,但剩余物质可在 4°C 下储存最多 4 周。
  8. TMB 底物 (#7004):使用前请恢复至室温。
  9. STOP 溶液 (#7002):使用前请恢复至室温。

B. 检测程序

:在运行检测之前,请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

  1. 如上(第 A 部分)所述制备所有试剂。
  2. 人来源的样品应按照认可的安全规范进行处理。样品(人血清或血浆)应至少用样品稀释剂 A 稀释 1:10(6.5 μL 样品+ 58.5 μL 样品稀释剂 A),如果用户需要相对定量,可以进一步进行梯度稀释。在复溶后不需要稀释阳性和阴性对照。当使用以下所述的临界标准来确定样品是否为抗 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白抗体阳性时,必须将以 1:10 稀释的样品与含有样品稀释剂 A 和 RBD-HRP(仅 RBD-HRP 的对照物)的混合物的孔进行比较,而阳性和阴性对照物则未稀释使用。在该实验步骤的末尾描述了一个计算百分比抑制的方程式。

    注意:样品的储存/处理(包括样品的热灭活)可能会影响观察到的信号。因此,强烈建议除了试剂盒中包含的阳性和阴性对照外,用户在运行分析时还应包括自己的阴性和阳性患者样品作为对照,以建立适当的临界值除了测试人血清/血浆外,该试剂盒还可用于评估非人抗体和小分子的阻断活性。在这种情况下,用户将必须确定要使用的样品的适当稀释度/浓度,以及运行适当的对照物。

  3. 将稀释的样品、阳性对照物、阴性对照物和样品稀释液 A(仅适用于 RBD-HRP 对照物)与 SARS-CoV-2 Spike RBD 蛋白预孵育,在单独的无涂层测定板或干净的微管中进行 HRP 连接。为此,在单独的未包被的孔/管中,将每个样品(稀释的 1:10)、阳性对照物、阴性对照物和样品稀释液 A(仅用于 RBD-HRP 对照物)的 65 μL与 65 μL经 HRP 连接的重组 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白。对于空白对照物,将 65 μL 样品稀释剂 A 与 65 μL HRP 稀释剂混合在另一个孔/管中(仅稀释剂)。用随附的密封胶带密封板或封闭微管,然后在 37°C 下孵育 1 小时。
  4. 轻轻撕下胶带,将上一步骤中预先孵育的混合物 100 μL 转移到随附的 ACE2 蛋白包被的微孔板的适当孔中。转移完成后,用提供的密封胶带密封反应板,然后在 37°C 下孵育 1 小时。
  5. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X ELISA 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。每次洗涤后,将孔吸干或倒空。倒转平板并用干净的纸巾将其吸干,以便除去每个孔中的残留溶液,但无论何时都不得让孔完全干燥。
    3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  6. 向每个孔添加 100 μl TMB 底物。密封反应板,在黑暗处 37°C 下孵育 10 分钟。
  7. 向每个孔中加入 100 μL STOP Solution,并轻轻摇动几秒钟。

    注意:初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP Solution,就变为黄色。

  8. 读取结果:
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。
  9. 数据分析:
    1. 从样品、仅 RBD-HRP 对照、阳性和阴性样品对照值中减去“空白”孔的吸光度 450 nm 值。
    2. 仅 RBD-HRP 的对照吸光度值应大于 1.0。
    3. 阳性和阴性对照均应在下述可接受的抑制百分比标准内。
    4. 要计算抑制百分比,请使用以下公式:

      100-[(样品的 OD 值 ÷ 仅 RBD-HRP 的 OD 值)x 100%]

    5. 结果解读*:

      20% 抑制- 阳性结果,检测到 SARS-CoV-2 阻断抗体。

      <20% 抑制-阴性结果,未检测到 SARS-CoV-2 阻断抗体。

      * 通过测定一组已确认的 SARS-CoV-2 阳性样品(来自诊断为 SARS-CoV-2 阳性和血清反应阳性的供体)和在 SARS-CoV-2 大流行之前收集的未感染的供体血清来确定实验临界值。研究人员可以使用其他样品建立或修改此临界值。

发布​于 2020 年 11 月 

实验步骤编号:2367

特异性/敏感性

SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit 可检测抗体的内源水平,该抗体阻断 SARS-CoV-2 刺突 RBD(318-541)蛋白与人 ACE2 之间的相互作用 (18-615)。该试剂盒旨在检测人血清/血浆中存在的封闭抗体,但是,它也可以用于评估非人抗体和小分子的封闭活性。

背景

COVID-19 疫情的病因是一种新型的高致病性冠状病毒,称为 SARS-CoV-2(严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2)。SARS-CoV-2 是冠状病毒家族的成员(1)。SARS-CoV-2 的基因组与其他冠状病毒相似,并且由四个关键结构蛋白组成:S,刺突蛋白;E,包膜蛋白;M,膜蛋白;N,核衣壳蛋白(2)。冠状病毒刺突蛋白是 I 类融合蛋白,具有胞外域、跨膜域和胞内尾巴(3,4)。高度糖基化的胞外域从病毒包膜表面突出,并促进与宿主细胞质膜的附着和融合。胞外域可进一步细分为宿主受体结合域(RBD)(S1)和膜融合(S2)亚基,它们是由宿主蛋白酶在 S1/S2 和 S2' 位点进行蛋白水解产生的。S1 和 S2 亚基在切割后仍保持结合并组装成冠状三聚体(2,4)。在人类中,SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 刺突蛋白均利用血管紧张素转化酶 2(ACE2)蛋白作为进入细胞的受体(5-7)。刺突蛋白亚基代表冠状病毒毒粒的关键抗原特征,因此代表疫苗、新型治疗性抗体和小分子抑制剂(8,9)的重要靶标。

  1. Zhou, P. et al. (2020) Nature 579, 270-3.
  2. Tortorici, M.A. and Veesler, D. (2019) Adv Virus Res 105, 93-116.
  3. Li, F. et al. (2006) J Virol 80, 6794-800.
  4. Li, F. (2016) Annu Rev Virol 3, 237-61.
  5. Shang, J. et al. (2020) Nature 581, 221-4.
  6. Wrapp, D. et al. (2020) Science 367, 1260-3.
  7. Yan, R. et al. (2020) Science 367, 1444-8.
  8. Yuan, Y. et al. (2017) Nat Commun 8, 15092.
  9. Amanat, F. and Krammer, F. (2020) Immunity 52, 583-9.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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