SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA Kit #69486

SARS-CoV-2 Spike RBD-ACE2 Blocking Antibody Detection ELISA 试剂盒

此试剂盒仅供研究使用。不得用于诊断或临床流程。

A. 溶液和试剂

注意：用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。仅制备实验当天所需的足够试剂。

1. ACE2 蛋白包被的微孔：在打开袋子/使用之前，将其全部恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
2. 1X ELISA 洗涤缓冲液：通过使用去离子水稀释 ELISA 洗涤缓冲液 (20X)（每个试剂盒中均有提供）至 1X 来制备。
3. 样品稀释剂 A：提供的稀释剂用于稀释样品以及复溶试剂盒中包括的阳性和阴性对照。
4. HRP 稀释剂：提供红色稀释剂，用于重组和稀释 HRP 连接的 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白（提供 11.0 mL，仅需要 8.0 mL）。
5. 与 HRP 链接的 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白：冻干后为红色蛋糕状或粉末。加入 1.0 mL HRP 稀释剂以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。如需配制最终使用溶液，则在一根干净试管中添加满 1.0 mL 重新配制的 HRP 链接的蛋白到 7.0 mL HRP 稀释剂中，轻轻混合。不要涡旋 HRP 链接的蛋白，因为这可能会对它的性能产生不利影响。为获得最佳结果，立即使用此工作液。未使用的工作液可能在 4°C 下储存最多 4 周，但与新制溶液相比可能会有一些信号损失。
6. 阳性对照：用 1.0 mL 样品稀释液 A 复溶冻干的阳性对照小瓶。轻轻充分混合，在室温下保持 1 分钟，然后按照“检测程序”部分中所述的步骤进行操作。建议在复溶后立即使用阳性对照，但剩余物质可在 4°C 下储存最多 4 周（与新鲜制备的溶液相比，阳性对照的阻断活性可能会有所降低）。阳性对照作为一种对照试剂提供，而不是作为一种绝对定量方法。
7. 阴性对照：用 1.0 mL 样品稀释液 A 复溶冻干的阴性对照小瓶。轻轻充分混合，在室温下保持 1 分钟，然后按照“检测程序”部分中所述的步骤进行操作。建议在复溶后立即使用阴性对照，但剩余物质可在 4°C 下储存最多 4 周。
8. TMB 底物 (#7004)：使用前请恢复至室温。
9. STOP 溶液 (#7002)：使用前请恢复至室温。

B. 检测程序

注：在运行检测之前，请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

1. 如上（第 A 部分）所述制备所有试剂。

2. 人来源的样品应按照认可的安全规范进行处理。样品（人血清或血浆）应至少用样品稀释剂 A 稀释 1：10（6.5 μL 样品+ 58.5 μL 样品稀释剂 A），如果用户需要相对定量，可以进一步进行梯度稀释。在复溶后不需要稀释阳性和阴性对照。当使用以下所述的临界标准来确定样品是否为抗 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白抗体阳性时，必须将以 1:10 稀释的样品与含有样品稀释剂 A 和 RBD-HRP（仅 RBD-HRP 的对照物）的混合物的孔进行比较，而阳性和阴性对照物则未稀释使用。在该实验步骤的末尾描述了一个计算百分比抑制的方程式。

   注意：样品的储存/处理（包括样品的热灭活）可能会影响观察到的信号。因此，强烈建议除了试剂盒中包含的阳性和阴性对照外，用户在运行分析时还应包括自己的阴性和阳性患者样品作为对照，以建立适当的临界值除了测试人血清/血浆外，该试剂盒还可用于评估非人抗体和小分子的阻断活性。在这种情况下，用户将必须确定要使用的样品的适当稀释度/浓度，以及运行适当的对照物。

3. 将稀释的样品、阳性对照物、阴性对照物和样品稀释液 A（仅适用于 RBD-HRP 对照物）与 SARS-CoV-2 Spike RBD 蛋白预孵育，在单独的无涂层测定板或干净的微管中进行 HRP 连接。为此，在单独的未包被的孔/管中，将每个样品（稀释的 1:10）、阳性对照物、阴性对照物和样品稀释液 A（仅用于 RBD-HRP 对照物）的 65 μL与 65 μL经 HRP 连接的重组 SARS-CoV-2 刺突 RBD 蛋白。对于空白对照物，将 65 μL 样品稀释剂 A 与 65 μL HRP 稀释剂混合在另一个孔/管中（仅稀释剂）。用随附的密封胶带密封板或封闭微管，然后在 37°C 下孵育 1 小时。
4. 轻轻撕下胶带，将上一步骤中预先孵育的混合物 100 μL 转移到随附的 ACE2 蛋白包被的微孔板的适当孔中。转移完成后，用提供的密封胶带密封反应板，然后在 37°C 下孵育 1 小时。
5. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
   1. 将平板内容物弃入容器中。
   2. 用 1X ELISA 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µl。每次洗涤后，将孔吸干或倒空。倒转平板并用干净的纸巾将其吸干，以便除去每个孔中的残留溶液，但无论何时都不得让孔完全干燥。
   3. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
6. 向每个孔添加 100 μl TMB 底物。密封反应板，在黑暗处 37°C 下孵育 10 分钟。

7. 向每个孔中加入 100 μL STOP Solution，并轻轻摇动几秒钟。

   注意：初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP Solution，就变为黄色。

8. 读取结果：
   1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
   2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。
9. 数据分析：
   1. 从样品、仅 RBD-HRP 对照、阳性和阴性样品对照值中减去“空白”孔的吸光度 450 nm 值。
   2. 仅 RBD-HRP 的对照吸光度值应大于 1.0。
   3. 阳性和阴性对照均应在下述可接受的抑制百分比标准内。
   4. 要计算抑制百分比，请使用以下公式：

      100-[（样品的 OD 值 ÷ 仅 RBD-HRP 的 OD 值）x 100％]

   5. 结果解读*：

      ≥20% 抑制- 阳性结果，检测到 SARS-CoV-2 阻断抗体。

      <20％ 抑制-阴性结果，未检测到 SARS-CoV-2 阻断抗体。

      * 通过测定一组已确认的 SARS-CoV-2 阳性样品（来自诊断为 SARS-CoV-2 阳性和血清反应阳性的供体）和在 SARS-CoV-2 大流行之前收集的未感染的供体血清来确定实验临界值。研究人员可以使用其他样品建立或修改此临界值。