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71484
PathScan® Phospho-Atg14 (Ser29) Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-Atg14 (Ser29) Sandwich ELISA Kit #71484

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PathScan® Phospho-Atg14 (Ser29) Sandwich ELISA Kit: Image 1
图 1. Atg14 在与表达人 Atg14 和小鼠 ULK1 的表达载体共转染的 293T 细胞中在 Ser29 位点磷酸化,但在仅用 Atg14 表达载体转染的细胞中未磷酸化。未经处理和已经过 λ 磷酸酶处理的小鼠脑提取物的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® Phospho-Atg14 (Ser29) Sandwich ELISA Kit #71484 时在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。使用 phospho-Atg14 (Ser29) antibody(左小图)和 Atg14 antibody(右小图)检测到的相应蛋白质印迹如下图所示。293T 细胞要么与表达 GFP 标记的人 Atg14 蛋白 (hAtg14-GFP) 和小鼠 ULK1 (mULK1) 的载体共转染,要么仅用表达 GFP 标记的人 Atg14 蛋白 (hAtg14-GFP) 的载体转染,然后裂解。
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71484C
1 个试剂盒(96 次检测)

重要订购明细

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支持数据

反应性 H

应用缩写:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Vir- Virus
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

PathScan® Phospho-Atg14 (Ser29) Sandwich ELISA Kit 是一种固相夹心酶联免疫吸附剂检测 (ELISA) 试剂盒,能检测在 Ser29 位点被磷酸化的 Atg14 蛋白的内源水平。在包被微孔板上孵育细胞裂解物和检测抗体,只需一步即可与在 Ser29 位点磷酸化的 Atg14 蛋白形成夹心结构。随后深度洗涤平板,并添加 TMB 试剂来产生信号。该显色的吸光度值与在 Ser29 位点被磷酸化的 Atg14 蛋白的数量成比例。

*试剂盒中的抗体为特定于该试剂盒的定制制剂。

实验步骤

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PathScan® Sandwich ELISA 实验步骤(一步式检测程序)

注意:此实验步骤适用于使用直接与检测抗体偶联的 HRP 的 PathScan® 试剂盒(一步式方法),而不是按顺序添加检测抗体和 HRP 偶联二抗的两步式方法。

关于实验孵育温度,请参考产品专用数据表。

A. 溶液和试剂

注意:用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。

  1. 微孔板条板:在打开袋子/使用之前,请将其全部恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
  2. 检测抗体:用 5.5 mL HRP 稀释剂重新配制冻干检测抗体(红色块状物)。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。为获得最佳结果,请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的检测抗体可在 4°C 下保存长达 4 周,尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
  3. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于用于重组和稀释与 HRP 相关的检测抗体。
  4. 1X ELISA 洗涤缓冲液:通过用去离子水将 ELISA Wash Buffer (20X)(每个试剂盒中均有提供)稀释至 1X 来制备。
  5. 1X 细胞裂解缓冲液:通过用去离子水将 10X Cell Lysis Buffer #9803 稀释至 1X 来制备。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用(1–2 周)。建议:用于制备细胞裂解物时,在使用前立即添加 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail(#5872,未提供)和 1 mM 苯甲基磺酰氟(PMSF,#8553,未提供)。
  6. TMB 底物 (#7004):使用前请恢复至室温。
  7. STOP 溶液 (#7002):使用前请恢复至室温。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液(含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail),平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 下微量离心(14,000 rpm)10 分钟,随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/mL 时,通过低速离心(约 1200 rpm)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 rpm)收集细胞,并用 5-10 mL 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 mL 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 mL 1X 细胞裂解缓冲液(含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail)中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 下微量离心(14,000 rpm)10 分钟,随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

注:在运行检测之前,请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

  1. 如上(第 A 部分)所述制备所有试剂。
  2. 样品应不作稀释或用 1X 细胞裂解缓冲液稀释至 2X 蛋白浓度,以便在添加检测抗体后达到最终的 1X 蛋白浓度。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型结果。
  3. 向对应的孔添加 50 μL 每种样品。
  4. 向每个孔中添加 50 µL 检测抗体。
  5. 对平板进行密封,并在室温下于设定为 400 rpm(中度振荡)的平板摇床上孵育 1 小时。
  6. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µL。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  7. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封并在平板摇床(400 rpm,中度振荡)上于室温下黑暗环境中对平板进行孵育 15 分钟,或者在不振荡的情况下于 37°C 下孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。
  9. 注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  10. 读取结果:
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

创建于 2020 年 7 月

实验步骤编号:2144

特异性/敏感性

PathScan® Phospho-Atg14 (Ser29) Sandwich ELISA Kit 可检测在 Ser29 位点被磷酸化 Atg14 蛋白的内源水平。该试剂盒的敏感度如结果图 1 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性:

背景

自噬是自噬溶酶体降解大部分细胞浆内容物的一种分解代谢过程 (1,2)。一般在营养匮乏的条件下激活自噬,但自噬也与许多生理过程相关,包括发育、分化、神经退行性疾病、感染和癌症 (3)。已在酵母中大量发现自噬的分子机制,该机制还受大量自噬相关 (Atg) 基因的调节。这些蛋白参与自噬体的形成,自噬体是被转运到溶酶体中进行降解的胞质液泡。III 型磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K) Vps34 可调节液泡转运和自噬 (4,5)。Vsp34 可结合许多蛋白,包括 p105/Vps15、Beclin-1, UVRAG、Atg14 和 Rubicon,从而确定 Vsp34 的功能 (6-12)。Atg14 和 Rubicon 根据其结合 Beclin-1 的能力进行鉴定,并在独特复合体中发挥抑制作用 (9-12)。位于内体和溶酶体的 Rubicon 会抑制 Vps34 脂质激酶活性;敲除 Rubicon 会增强自噬和内吞转运 (11,12)。相比之下,Atg14 位于自噬体、隔离膜和内质网,并可增强 Vps34 活性。敲除 Atg14 会抑制饥饿诱导的自噬 (11,12)。
丝氨酸/苏氨酸激酶 ULK1 在 Ser29 位点磷酸化 Atg14,进而促进自噬体形成 (13)。
  1. Reggiori, F. and Klionsky, D.J. (2002) Eukaryot Cell 1, 11-21.
  2. Codogno, P. and Meijer, A.J. (2005) Cell Death Differ 12 Suppl 2, 1509-18.
  3. Itakura, E. et al. (2008) Mol Biol Cell 19, 5360-72.
  4. Matsunaga, K. et al. (2009) Nat Cell Biol 11, 385-96.
  5. Park, J.M. et al. (2016) Autophagy 12, 547-64.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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