PathScan^® Phospho-AMPKα (Thr172) Sandwich ELISA Kit #7959

ELISA 比色法（冻干）

A. 溶液与试剂

注意：用纯净水配制溶液。

1. 微孔测试条：使用前，将所有测试条放至室温。
2. 检测抗体：以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂（绿色溶液）以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。如需配制最终使用溶液，则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中，轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
3. HRP-Linked Antibody *：以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂（红色溶液）以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。如需配制最终使用溶液，则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中，轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
4. 检测抗体稀释剂：绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体（提供 11 ml）。
5. HRP 稀释剂：红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody（提供 11 ml）。
6. 样品稀释剂：蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
7. 1X 洗涤缓冲液：用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液（包含在每个 PathScan^®Sandwich ELISA Kit 中）来制备。
8. 细胞裂解缓冲液：PathScan^® Sandwich ELISA Lysis Buffer (1X) #7018：该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用（1-2 周）。建议：使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
9. TMB 底物 (#7004)。
10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意：一些 PathScan^® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5- 1 ml 冰冷的 PathScan^® 夹心式 ELISA 裂解缓冲液 (1X) #7018 + 1 mM PMSF，平板放在冰上孵育 2 分钟。
4. 将细胞裂解物采集到一根干净的试管中。
5. 在 4°C 下离心分离 10 分钟 (14,000 x g)，并将上清液转移到新试管中。上清液按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 10⁶ 个活细胞/ml 时，通过低速离心（约 1200 转/分钟）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 通过低速离心（约 1200 转/分钟）收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
4. 重悬细胞沉淀物，试管在冰上孵育 2 分钟。
5. 在 4°C 微量离心 10 分钟（x14,000 转/分钟），并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

1. 当微孔板条达到室温后，掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封，并立即保存在 4°C 下。
2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂（包含在每个 PathScan^® Sandwich ELISA Kit 中，蓝色）稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
3. 从每种未稀释或已稀释的细胞裂解物中取出 100 μl 添加到相应孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外，也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
   1. 将平板内容物弃入容器中。
   2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µl。
   3. 每次洗涤时，将平板重重拍在未用过的毛巾上，以便去除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让微孔完全干燥。
   4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
5. 向每个孔添加 100 μl 重新配制的检测抗体（绿色）（参阅部分 A，步骤 2）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 1 小时。
6. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
7. 向每个孔添加 100 μl 重新配制的 HRP 标记二抗（红色）（参阅部分 A，步骤 3）。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
8. 重复洗涤程序（C 部分，步骤 4）。
9. 向每个孔添加 100 μl TMB 底物。用胶带密封，平板在 37°C 下孵育 10 分钟，或在 25°C 下孵育 30 分钟。
10. 向每个孔添加 100 μl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

11. 读取结果。
    1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。