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7932
PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred)
ELISA 试剂盒
ELISA 试剂盒

PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred) #7932

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PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred): Image 1
图 1:NIH/3T3 细胞用 PDGF #9909 处理会刺激Akt2在Ser474位点的磷酸化,可使用 PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred) #7932 可进行检测,但不影响 PathScan® Total Akt2 Sandwich ELISA kit (Mouse Preferred) #7930 检测的 Akt2 总蛋白水平。在 450 nm 处的吸光度读数如顶部图所示,使用 Akt2 (5B5) Rabbit mAb #2964(左小图)和 Phospho-Akt (Ser473) (193H12) Rabbit mAb #4058(右小图)识别的相应蛋白质印迹如底部图所示。
PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred): Image 2
图 2:使用重组磷酸化 Akt1、Akt2 和 Akt3 蛋白可证实 phospho-Akt protein sandwich ELISA kit 的特异性。#7160 可检测磷酸-Akt1 (Ser473),而 #7932 则可检测磷酸-Akt2 (Ser474) 的水平。使用两种 ELISA 试剂盒可测定重组磷酸化 Akt 蛋白(每个微孔 1.0 ng)。
PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred): Image 3
图 3:未经处理或已经 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞的裂解物蛋白浓度与在 450 nm 处的吸光度之间的关系如图所示。饥饿后,NIH/3T3 细胞(85% 融合度)在 37ºC 下用 PDGF #9909 (50 ng/ml) 处理 10 分钟后再进行裂解。
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7932C
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支持性数据

反应性 M

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
Phospho-Akt Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
Akt2 Mouse Detection mAb 1 个 绿色(冻干)
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (ELISA Formulated) 1 个 红色(冻干)
Detection Antibody Diluent 11 ml 绿色
HRP Diluent 11 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
ELISA Sample Diluent 25 ml 蓝色
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

产品说明

CST 的 PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred) 是一种固相夹心酶联免疫吸附检测 (ELISA) 试剂盒,能够检测在 Ser474 位点被磷酸化的内源水平的 Akt2 蛋白。phospho-Akt rabbit antibody 包被在微孔中。用细胞裂解物孵育后,该包被抗体可捕获磷酸-Akt 蛋白。充分洗涤后,加入 Akt2 mouse antibody 来检测捕获的磷酸-Akt2 蛋白。随后使用 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody* 检测结合的检测抗体。加入 HRP 底物 TMB 来显色。该显色的吸光度值与在 Ser474 位点被磷酸化的 Akt2 的数量成比例。

*该试剂盒中的抗体为该试剂盒的定制制剂。

实验步骤

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ELISA 比色法(冻干)

A. 溶液与试剂

注意:用纯净水配制溶液。

  1. 微孔测试条:使用前,将所有测试条放至室温。
  2. 检测抗体:以冻干的绿色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml 检测抗体稀释剂(绿色溶液)以配制浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的检测抗体到 10.0 ml 检测抗体稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  3. HRP-Linked Antibody *:以冻干的红色块状或粉末形式保存。加入 1.0 ml HRP 稀释剂(红色溶液)以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟,同时不时轻轻混合,以充分重新配制。如需配制最终使用溶液,则在一根干净试管中添加满 1.0 ml 重新配制的 HRP-Linked Antibody 到 10.0 ml HRP 稀释剂中,轻轻混合。未使用的使用溶液可在 4°C 下保存 4 周。
  4. 检测抗体稀释剂:绿色稀释剂用于重新配制和稀释检测抗体(提供 11 ml)。
  5. HRP 稀释剂:红色稀释剂用于重新配制和稀释 HRP-Linked Antibody(提供 11 ml)。
  6. 样品稀释剂:蓝色稀释剂用于稀释细胞裂解物。
  7. 1X 洗涤缓冲液:用纯净水稀释 20X 洗涤缓冲液(包含在每个 PathScan®Sandwich ELISA Kit 中)来制备。
  8. 细胞裂解缓冲液10X 细胞裂解缓冲液 #9803:该缓冲液可保存在 4°C 下供短期使用(1-2 周)。建议:使用前立即添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
  9. TMB 底物 (#7004)。
  10. STOP 溶液 (#7002)。

*注意:一些 PathScan® ELISA Kit 可能用 HRP-Linked Streptavidin 替代 HRP-Linked Antibody。

B. 制备细胞裂解物

针对粘附细胞。

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时,吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS,每块平板(10 cm 直径)添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液 + 1 mM PMSF,平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/ml 时,通过低速离心(约 1200 转/分钟)移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心(约 1200 转/分钟)收集细胞并用 5–10 ml 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 ml 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 ml 1X 细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF 中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 微量离心 10 分钟(x14,000 转/分钟),并将上清液转移至一个新试管。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

  1. 当微孔板条达到室温后,掰下所需的微孔量。将微孔至于在板条架中。未使用的微孔必须重新密封,并立即保存在 4°C 下。
  2. 细胞裂解物可以不稀释或用样品稀释剂(包含在每个 PathScan® Sandwich ELISA Kit 中,蓝色)稀释。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线,可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型试剂盒测定结果。
  3. 从每种未稀释或稀释的细胞裂解物中取出 100 µl 添加至适当的孔中。用胶带密封并牢固地按压在微孔顶部。平板在 37°C 下孵育 2 小时。此外,也可以在 4 °C 孵育平板过夜。
  4. 轻轻取下胶带并洗涤各孔:
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次,每孔每次 200 µl。
    3. 每次洗涤时,将平板重重拍在未用过的毛巾上,以便去除每个孔中的残余溶液,但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  5. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的检测抗体(绿色)(参阅 A 部分,步骤 2)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 1 小时。
  6. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  7. 向每个孔添加 100 µl 重新配制的 HRP 标记二抗(红色)(参阅 A 部分,步骤 3)。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 30 分钟。
  8. 重复洗涤程序(C 部分,步骤 4)。
  9. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封,平板在 37°C 下孵育 10 分钟,或在 25°C 下孵育 30 分钟。
  10. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

注意:阳性反应的初始颜色为蓝色,一旦添加 STOP 溶液,就变为黄色。

  1. 读取结果。
    1. 目测:在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定:用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内,读取在 450 nm 处的吸光度。

发布​时间 2013 年 11 月

实验步骤编号:204

特异性/灵敏度

CST 的 PathScan® Phospho-Akt2 (Ser474) Sandwich ELISA Kit (Mouse Preferred) 可检测小鼠 (NIH/3T3) 细胞中在 Ser474 位点被磷酸化的内源水平的 Akt2 蛋白,如图 1 所示。磷酸-Akt 蛋白的特异性如图 2 所示,Akt2 kit 的敏感性如图 3 所示。

背景

Akt 也称作 PKB 或 Rac,在控制存活和凋亡中发挥至关重要作用 (1-3)。这种蛋白激酶由胰岛素和多种生长和存活因子激活,并在涉及 PI3 激酶的 wortmannin 敏感通路中发挥作用 (2,3)。通过磷脂结合过程并由 PDK1 在 Thr308 位点磷酸化激活环 (4) ,以及通过羧基末端内部 Ser473 处的磷酸化激活 Akt。曾经功能难以捉摸的 PDK2 可在 Ser473 处磷酸化 Akt ,它被鉴定为在含 rictor 和 Sin1 的雷帕霉素中的非敏感复合体中哺乳动物雷帕霉素靶标 (mTOR) (5,6)。Akt 通过磷酸化和失活几种靶标(包括 Bad (7)、叉头转录因子 (8)、c-Raf (9) 和 caspase-9)而抑制凋亡,进而促进细胞存活。PTEN 磷酸酶是 PI3K/Akt 信号转导通路的主要负向调节分子 (10)。LY294002 是特异性 PI3 激酶抑制剂 (11)。Akt 的另一个主要功能是通过磷酸化和失活 GSK-3α 和 β 调节糖原合成 (12,13)。Akt 还可以在胰岛素刺激转运葡萄糖中发挥作用 (12)。除其在存活和糖原合成中的作用外,Akt 还通过防止 GSK-3β 介导的磷酸化和周期蛋白 D1 降解 (14) 并通过负向调节周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白 p27 Kip1 (15) 和 p21 Waf1/Cip1 (16) 来参与细胞周期调节。Akt 还通过直接磷酸化含有 raptor 的雷帕霉素敏感性复合体中的 mTOR,在细胞生长中发挥至关重要作用 (17)。更重要地,Akt 使结节蛋白 (TSC2)( mTOR-raptor 复合体中 mTOR 的抑制物)磷酸化并失活(18,19)。

  1. Franke, T.F. et al. (1997) Cell 88, 435-7.
  2. Burgering, B.M. and Coffer, P.J. (1995) Nature 376, 599-602.
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  4. Alessi, D.R. et al. (1996) EMBO J 15, 6541-51.
  5. Sarbassov, D.D. et al. (2005) Science 307, 1098-101.
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  7. Cardone, M.H. et al. (1998) Science 282, 1318-21.
  8. Brunet, A. et al. (1999) Cell 96, 857-68.
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  18. Inoki, K. et al. (2002) Nat Cell Biol 4, 648-57.
  19. Manning, B.D. et al. (2002) Mol Cell 10, 151-62.

通路

探索与本品相关的通路。

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