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76145
PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit
ELISA 试剂盒
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PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit #76145

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PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit: Image 1
图 1. PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit #76145 检出人 ApoE4 蛋白，但不检出 ApoE2 或 ApoE3。左图中显示使用 PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit #76145 时，一组细胞提取物和组织提取物（每份样品为 0.05 mg/mL）的 450 nm 处吸光度如。右图中显示使用 ApoE4 抗体和 ApoE (pan) 抗体的相应蛋白质印迹（这两种抗体有人类反应性，而无小鼠/大鼠反应性）。提取物制备自各种细胞/组织，包括经空载转染 (293T/模拟) 或经表达全长人 ApoE2 (293T/ApoE2)、全长人 ApoE3 (293T/ApoE3) 或 全长人 ApoE4 (293T/ApoE4) 的构建体转染的 293T 细胞。
PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit: Image 2
图 2. 显示了经表达全长人 ApoE4 的构建体转染的 293T 细胞的裂解物蛋白浓度与使用 PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit #76145 时 450 nm 处吸光度之间的关系。
PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit: Image 3
图 3. PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit #76145 可检测阿尔茨海默病 (AD) 患者脑脊液 (CSF)、血浆和血清中的 ApoE4。该图显示了从一名 AD 患者和一名正常供体获得的 3 份人 CSF、血浆和血清稀释物的 450 nm 处吸光度。
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76145C		 1 个试剂盒（96 次检测）

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支持性数据

反应性 H

应用关键词：

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词：

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种
产品包括 体积 溶液颜色
ApoE (pan) Rabbit mAb Coated Microwells 96 次测试
ApoE4 Mouse Detection mAb 1 个 红色（冻干）
HRP Diluent 5.5 ml 红色
TMB Substrate 7004 11 ml
STOP Solution 7002 11 ml
Sealing Tape 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 25 ml
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 15 ml

产品说明

PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit 是一种检测内源水平 ApoE4 的固相夹心酶联免疫吸附测定法 (ELISA)。在包被微孔板上孵育细胞裂解物和检测抗体，只需一步即与 ApoE4 形成夹心结构。随后深度洗涤平板，并添加 TMB 试剂来产生信号。已显颜色的吸光度值与 ApoE4 的量成比例。

*试剂盒中的抗体为专属该试剂盒的定制制剂。

实验步骤

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PathScan® Sandwich ELISA 实验步骤（一步式检测程序）

注意：此实验步骤适用于使用直接与检测抗体偶联的 HRP 的 PathScan® 试剂盒（一步式方法），而不是按顺序添加检测抗体和 HRP 偶联二抗的两步式方法。

关于实验孵育温度，请参考产品专用数据表。

A. 溶液与试剂

注意：用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。

  1. 微孔板条板：在打开袋子/使用之前，请将其全部恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
  2. 检测抗体：用 5.5 mL HRP 稀释剂重新配制冻干检测抗体（红色块状物）。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分重新配制。为获得最佳结果，请在重新配制抗体后立即使用。未使用的经重新配制的检测抗体可在 4°C 下保存长达 4 周，尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号丢失。
  3. HRP 稀释剂：红色稀释剂用于用于重组和稀释与 HRP 相关的检测抗体。
  4. 1X ELISA 洗涤缓冲液：通过用去离子水将 ELISA Wash Buffer (20X)（每个试剂盒中均有提供）稀释至 1X 来制备。
  5. 1X 细胞裂解缓冲液：通过用去离子水将 10X Cell Lysis Buffer #9803 稀释至 1X 来制备。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用（1–2 周）。建议：用于制备细胞裂解物时，在使用前立即添加 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail（#5872，未提供）和 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF，#8553，未提供）。
  6. TMB 底物 (#7004)：使用前请恢复至室温。
  7. STOP 溶液 (#7002)：使用前请恢复至室温。

B. 制备细胞裂解物

对于贴壁细胞

  1. 当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 移除培养基并将细胞用冰冷的 1 X PBS 润洗一次。
  3. 去除 PBS，每块平板（10 cm 直径）添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail），平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
  5. 在冰上超声处理裂解物。
  6. 在 4°C 下微量离心（14,000 rpm）10 分钟，随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

  1. 当培养物达到 0.5–1.0 x 106 个活细胞/mL 时，通过低速离心（约 1200 rpm）移除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 通过低速离心（约 1200 rpm）收集细胞，并用 5-10 mL 冰冷的 1 X PBS 洗涤一次。
  3. 从 50 mL 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 mL 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail）中进行裂解。
  4. 在冰上超声处理裂解物。
  5. 在 4°C 下微量离心（14,000 rpm）10 分钟，随后将上清液转移到一根新的试管中。上清液即为细胞裂解物。按一次性等量样品保存在 -80°C 下。

C. 检测程序

注：在运行检测之前，请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

  1. 如上（第 A 部分）所述制备所有试剂。
  2. 样品应不作稀释或用 1X 细胞裂解缓冲液稀释至 2X 蛋白浓度，以便在添加检测抗体后达到最终的 1X 蛋白浓度。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。敏感度曲线显示了所有裂解物浓度点的典型结果。
  3. 向对应的孔添加 50 μL 每种样品。
  4. 向每个孔中添加 50 µL 检测抗体。
  5. 对平板进行密封，并在室温下于设定为 400 rpm（中度振荡）的平板摇床上孵育 1 小时。
  6. 轻轻取下胶带并洗涤各孔：
    1. 将平板内容物弃入容器中。
    2. 用 1X 洗涤缓冲液洗涤 4 次，每孔每次 200 µL。
    3. 每次洗涤时，将平板重重拍在未用过的毛巾上，以便去除每个孔中的残余溶液，但无论何时都不应让微孔完全干燥。
    4. 用无绒织物清洁全部孔的底面。
  7. 向每个孔添加 100 µl TMB 底物。用胶带密封并在平板摇床（400 rpm，中度振荡）上于室温下黑暗环境中对平板进行孵育 15 分钟，或者在不振荡的情况下于 37°C 下孵育 10 分钟。
  8. 向每个孔添加 100 µl STOP 溶液。温和振摇数秒。

    9. 注意：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP 溶液，就变为黄色。

  9. 读取结果：
    1. 目测：在添加 STOP 溶液后 30 分钟内读取。
    2. 分光光度法测定：用无绒薄布擦拭各孔底部。添加 STOP 溶液后 30 分钟内，读取在 450 nm 处的吸光度。

创建于 2020 年 7 月

实验步骤编号：2144

特异性/灵敏度

PathScan® ApoE4 Sandwich ELISA Kit 检测内源水平的 ApoE4 蛋白，但不与 ApoE2 或 ApoE3 交叉反应，如图 1 所示。该试剂盒的敏感度如图 2 所示。经内部测试确定，该试剂盒可检测规定物种中的蛋白，但也可能检测其他物种的同源蛋白。

背景

载脂蛋白属于血脂蛋白，在循环系统脂肪和胆固醇中充当转运蛋白的作用。乳糜微粒是一种基础载脂蛋白，同时含有极低密度脂蛋白 (VLDL)、中等密度脂蛋白 (IDL)、低密度脂蛋白 (LDL) 以及高密度脂蛋白 (HDL) (1,2)。
人 ApoE 包括三种同工型：ApoE2、ApoE3 和 ApoE4。这三种同工型不同与位于130和176的半胱氨酸和精氨酸残基的组合。ApoE4 同工型的两个部位均含有精氨酸。研究发现 ApoE4 功能与神经元可塑性、突触发育以及神经退行性疾病 (3) 有关。ApoE4 产生于肝脏和大脑中，尽管它在其他组织中有广泛的表达（例如肺部、脾脏和卵巢）。研究人员将 ApoE4 等位基因确定为阿尔茨海默病 (AD) 的遗传风险因子，同时占该病 (4) 遗传变异的 50-60%。研究显示表达 ApoE4 的患者出现突触可塑性减弱，AD 开始的年龄提前，以及 β 淀粉样蛋白 (Aβ) 沉积增加的现象。Aβ 增加表明 ApoE4 对淀粉样蛋白清除作用受损 (5)。

限制使用

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