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使用 SimpleChIP® Human γ-Actin Promoter Primers 进行实时 PCR 反应可获得 PCR 产物熔解曲线。数据显示为使用 20 ng 总 DNA 进行的两次重复 PCR 反应。溶解曲线由 80 个熔化期组成，从 55°C 开始，每个周期增加 0.5°C。每个 PCR 产物降解时会形成一个吸收峰。
对使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003 从交联细胞中分离的 DNA 检测 SimpleChIP® Human γ-Actin Promoter Primers。使用实时 PCR 检测系统和 SYBR® Green 反应混合物，对梯度稀释的 2% 总输入 DNA（20 ng、4 ng、0.8 ng 和 0.16 ng）重复进行实时 PCR。根据 40 个实时 PCR（在 95°C 下变性 15 秒钟，在 65°C 下退火/延伸 60 秒钟）周期期间每份稀释样品的相应循环阈值 (CT)，计算 PCR 扩增效率 (E) 和相关系数 (R2)。
| 产品货号 | 规格 | 价格 | 库存 |
|---|---|---|---|
| 5037S | 500 µl （250 次 PCR 反应） |
| 反应性 | H |
产品信息
SimpleChIP® Human γ-Actin Promoter Primers 包含一个针对人 γ 肌动蛋白启动子某个区域特异的正向和反向 PCR 引物混合物。这些引物可用于扩增经染色质免疫沉淀法 (ChIP) 分离的 DNA。引物经优化可用于 SYBR® Green 定量实时 PCR，并连同 Cell Signaling Technology® 的 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kits #9002 和 #9003 以及经 ChIP 验证的抗体进行了测试。γ-肌动蛋白基因在所有细胞类型中活跃转录，其启动子的高度富集可促进与活跃转录有关的组蛋白修饰，如组蛋白 H3 Lys4 三甲基化和一般组蛋白乙酰化。该基因启动子显示，与异染色质有关的组蛋白修饰（如组蛋白 H3 Lys9 或 Lys27 三甲基化）水平非常低。
1. 标记适量与要使用的实时 PCR 仪器型号相适应的相应 PCR 试管或 PCR 平板数量。PCR 反应（的每一个样品）应以重复一次的方式进行，并应包含一只不含 DNA 且用于观察污染的试管，以及梯度稀释的 2% 总输入染色质 DNA（未稀释、1:5、1:25、1:125）以用于生成标准曲线并确定扩增效率。2. 向每只试管或 PCR 平板的每个孔添加 2 μl 相应 ChIP DNA 样品。
3. 按下文所述制备主 PCR 反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每只PCR 反应试管或 PCR 平板的每个孔添加 18 μl 主 PCR 反应混合物。
1 次 PCR 反应的试剂量 (20 μl)
不含核酸酶的 H2O 6 μl
5 μM SimpleChIP® Primers 2 μl
2X SYBR® Green Reaction Mix 10 μl
4. 启动以下 PCR 反应程序：
a. 初始变性：在 95°C 下进行 3 分钟。
b. 变性：在 95°C 下进行 15 秒钟。c. 退火和延伸：在引物特定温度下进行 60 秒钟。
d. 重复步骤 b 和 c，共循环 40 次。
5. 使用实时 PCR 仪器提供的软件分析定量 PCR 结果。
保存在浓度为 5 μM（每种引物的最终浓度为 5 μM）的无核酸酶水中。储存于 -20°C 的温度下。
人
染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定法是一种用于在细胞天然染色质背景下探测蛋白质-DNA 相互作用的强大的通用技术 (1,2)。这种测定法用于检测与基因组某个特定区域有关的多种蛋白，或检测某种特殊蛋白结合的基因组的多个区域 (3-6)。ChIP 可用于确定各种蛋白被募集到某个基因启动子上的特定顺序，或用于“测定”整个基因位点上某种特定组蛋白修饰的相对数量 (3,4)。除了组蛋白外，ChIP 测定法还可用于分析转录因子与辅助因子、DNA 复制因子和 DNA 修复蛋白的结合。进行 ChIP 检测时，细胞首先用甲醛固定，甲醛是一种可逆的蛋白-DNA 交联剂，可以“维持”细胞内发生的蛋白-DNA 相互作用 (1,2)。细胞进行裂解，染色质采集后使用超声处理或酶消化法进行碎裂。碎裂的染色质随后使用对某种特殊蛋白或组蛋白修饰具有特异性的抗体进行免疫沉淀。任何与目标蛋白或组蛋白修饰有关的 DNA 序列都会作为交联染色质复合体的一部分进行共沉淀，并且该 DNA 序列的相对数量会在免疫选择过程中达到富集。免疫沉淀后，蛋白质-DNA 交联被逆转，DNA 得以纯化。标准 PCR 或定量实时 PCR 常用于测量通过蛋白特异性免疫沉淀达到富集的特定 DNA 序列数量 (1,2)。或者，ChIP 测定法还可与基因组微芯片（芯片上的 ChIP）技术、高通测序 (ChIP-Seq) 或克隆策略联合使用，它们都能对蛋白-DNA 相互作用和组蛋白修饰进行全基因组分析 (5-8)。SimpleChIP® 引物经优化可用于通过实时定量 PCR 扩增 ChIP 分离的 DNA，并提供用于确认 ChIP 试验是否成功的重要阳性和阴性对照。
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