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4339
Cyclic AMP XP® Assay Kit
细胞检测试剂盒
检测试剂盒

Cyclic AMP XP® Assay Kit #4339

引用 (1)
ELISA Image 1 - Cyclic AMP XP® Assay Kit

图 2:CHO 细胞用 Forskolin #3828 处理会导致 cAMP 浓度升高,使用 Cyclic AMP XP® Assay Kit #4339 可进行检测。CHO 细胞按 4x104 个细胞/孔放在 96 孔板上进行培养,并孵育过夜。细胞未经处理或用 0.5 mM IBMX 预处理 30 分钟,随后进行 forskolin 处理(15 分钟)并用 1X Cell Lysis Buffer #9803 进行裂解。吸光度值(左图)和活性百分比(右图)如上所示。活性百分比按照以下公式计算:% 活性 = 100x [(A-A本底)/(A最大-A本底)],其中 A 为样品吸光度,A最大为最大刺激(即高 forskolin 浓度)时的吸光度,A 本底为在本底水平(无 forskolin)时的吸光度。Forskolin 会直接激活腺苷酸环化酶,并使细胞 cAMP 浓度升高。IBMX 是 cAMP 和 cGMP 磷酸二酯酶的一种非特异性抑制剂,能促进 cAMP 和 cGMP 在细胞中聚集。

ELISA Image 2 - Cyclic AMP XP® Assay Kit

图 3:293 细胞用异丙肾上腺素处理会导致 cAMP 浓度升高,使用 Cyclic AMP XP® Assay Kit #4339 可进行检测。293 细胞按 3x104 个细胞/孔在 96 孔板中培养,并孵育过夜。细胞用 0.5 mM IBMX 预处理 30 分钟,随后进行异丙肾上腺素处理(3 分钟)并用 1X Cell Lysis Buffer #9803 进行裂解。吸光度值(左图)和活性百分比(右图)如上所示。活性百分比按照以下公式计算:% 活性 = 100* [(A-A本底)/(A最大-A本底)],其中 A 为样品吸光度,A最大为最大刺激(即高异丙肾上腺素浓度)时的吸光度,A 本底为在本底水平(无异丙肾上腺素)时的吸光度。异丙肾上腺素是一种 β-肾上腺受体激动剂,并能激活在 293 细胞中呈内源性表达的 β-2 肾上腺素能受体 (ADRB2)。ADRB2 激活会导致腺苷酸环化酶激活以及 cAMP 合成为其第二信使。

ELISA Image 3 - Cyclic AMP XP® Assay Kit

图 1:cAMP 标准液用 1X Cell Lysis Buffer #9803 稀释,并且样品遵照 Cyclic AMP XP® Assay Kit 实验步骤进行检测。该标准曲线仅用作演示目的;用户应为每个样品组制成标准曲线,以准确确定 cAMP 浓度。

购买 # 4339S
产品货号 规格 价格 库存
4339S
1 个试剂盒(96 次检测)

产品包括 数量(计数) 溶液颜色
cAMP Rabbit mAb Coated Microwells 1 x 96 次检测
cAMP-HRP Conjugate 1 x 11 ml 红色
cAMP Standard (2.4 uM) 1 x 1 ml
TMB Substrate 7004 1 x 11 ml
STOP Solution 7002 1 x 11 ml
Sealing Tape 1 x 2 ea
ELISA Wash Buffer (20X) 9801 1 x 10 ml
Cell Lysis Buffer (10X) 9803 1 x 15 ml

实验步骤

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酶免疫检测实验步骤

A. 试剂制备

  1. 使用前,让全部微孔板条达到室温。
  2. 通过在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 20 X 洗涤缓冲液(包含于每个试剂盒中),制备 1 X 洗涤缓冲液。
  3. 在 Milli-Q 或同等纯化的水中稀释 10 X Cell Lysis Buffer #9803 至 1 X。应当每次现添加 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。这种缓冲液可以贮存在 4°C 供短期使用(1–2 周)。

B 细胞裂解物制备

注意:该步骤适用于 96 孔组织培养平板。可以在对其修改后用于其他组织培养板(6、12、24 或 48 孔)。

  1. 将目的细胞铺种于 96 孔板中(一般在 6–100 X 103个细胞/孔之间)并且在适宜的细胞培养条件下孵育过夜
  2. 用 200 µl 温暖的 PBS 润洗细胞,随后在无血清培养基中添加测试化合物并且将细胞孵育所需时间段。
  3. 用 200 µl 冰冷的 PBS 润洗细胞 2 次,并且随后添加 100μl/孔 1 X 裂解缓冲液,于冰上放置 510 分钟。

注意:如果观察到细胞碎片,可以通过短暂离心分离平板来去除,并将澄清的裂解物转移到新的 96 孔板上。

C. 测定

  1. 让全部试剂盒组分达到室温。
  2. 添加 50 µl HRP 连接的靶标溶液和 50μl 样品至抗体包被的分析平板。盖住平板并且在水平圆周式平板摇床上室温孵育 3 小时。
  3. 弃去平板内容物并用 200μl/孔 1 X 洗涤缓冲液洗涤各孔 4 次。确保每次洗涤后弃去全部液体,但不应让孔完全干燥。
  4. 添加 100μl TMB Substrate。
  5. 在室温孵育 30 分钟。

注意:观察是否显色,因为可能需要在 30 分钟前停止反应。

  1. 添加 100μl STOP Solution。
  2. 测量吸光度在 450 nm(为得到最佳结果,在添加 STOP Solution 后 30 分钟内读取平板)。

注意:为了确定检测物质的绝对量,需要每次都建立标准曲线。请遵循产品数据表上的详细实验步骤以确定标准曲线的浓度范围。

发布​于 2010 年 4 月 

实验步骤编号:68

产品说明

Cyclic AMP XP® Assay Kit 是一种用于确定目标细胞或组织中 cAMP 水平的竞争性酶联免疫检测试剂盒。在该测定中,检测样品中的 cAMP 与固定量的 HRP 标记 cAMP 竞争性结合固定在 96 孔板上的 anti-cAMP XP® Rabbit mAb。洗涤并去除多余样品 cAMP 和 HRP 标记的 cAMP 后,加入 HRP 底物 TMB 来显色。鉴于该检测的竞争性质,该显色的吸光度值与样品 cAMP 的数量成反比。使用 cAMP 标准液测量吸光度,以计算某种目标样品中 cAMP 的绝对量。

注意:12、8 孔模型 - 每个模型可分开用于 8 次检测。

特异性/敏感性

测试该试剂盒对以下物质的免疫反应性:ADP、AMP、ATP、cAMP、cGMP、cIMP、cTMP、CTP、GDP、GMP 和 GTP。观察到与 cGMP 和 cIMP 具有相对轻微的交叉反应性,与 cGMP 或 cIMP 相比,对 cAMP 的敏感性高出 10 多倍。未观察到与任何其他检测因子具有交叉反应性。如图 1 所示,试剂盒敏感性的动态范围为 0.2 - 12 nM cAMP。特殊处理后的细胞 cAMP 水平变化如图 2(CHO 细胞)和图 3(293 细胞)所示。

物种反应性:

预期的所有物种

背景

环核苷酸 3’,5’-单磷酸 (cAMP) 是一种重要的第二信使,与许多物种中不同细胞类型的许多信号转导通路有关 (1-3)。在哺乳动物细胞中,腺苷酸环化酶 (AC) 会产生这种重要的分子。神经递质、激素、趋化因子、脂质介导物和药物等胞外刺激可调节 AC 活性,以通过结合大量跨膜 G 蛋白偶联受体来增加或减少 cAMP 的产生 (4)。磷酸二酯酶可催化 cAMP 降解为 AMP,而胞内核甘酸浓度、磷酸化或 Ca2+/钙调素与其他调节蛋白的结合均可调控磷酸二酯酶 (5)。cAMP 依赖性蛋白激酶 (PKA)、环核苷酸门控离子通道以及 cAMP (Epac) 激活的交换蛋白等不同分子可介导下游 cAMP 信号转导 (6,7)。cAMP 能调控各种生物进程,包括代谢、分化、心肌细胞功能、神经元信号转导、细胞黏附和免疫功能 (5-7)。

  1. Serezani, C.H. et al. (2008) Am J Respir Cell Mol Biol 39, 127-32.
  2. Beavo, J.A. and Brunton, L.L. (2002) Nat Rev Mol Cell Biol 3, 710-8.
  3. Kopperud, R. et al. (2003) FEBS Lett 546, 121-6.
  4. Kamenetsky, M. et al. (2006) J Mol Biol 362, 623-39.
  5. Cheng, J. and Grande, J.P. (2007) Exp Biol Med (Maywood) 232, 38-51.
  6. Holz, G.G. et al. (2006) J Physiol 577, 5-15.
  7. Taylor, S.S. et al. (2008) Biochim Biophys Acta 1784, 16-26.
仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。
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