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8818
Active Rap1 Detection Kit
细胞检测试剂盒
检测试剂盒

Active Rap1 Detection Kit #8818

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图 2. 如图所示,GTP 结合 GTP 酶沉淀过程可分为 3 个步骤。第 1 步:在旋转杯中混合样品、结合蛋白和谷胱甘肽树脂,并在 4ºC 下孵育,以使 GTP 结合的 GTP 酶通过 GST 连接的结合蛋白与谷胱甘肽树脂结合。第 2 步:通过离心分离去除未结合的蛋白。第 3 步:用 SDS 缓冲液洗脱结合谷胱甘肽树脂的 GTP 酶。洗脱样品随后通过蛋白质印迹实验进行分析。

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图 1. NIH/3T3 细胞裂解物(500 µl,1 mg/ml)在体外用 GTPγS 或 GDP 处理会使 Rap1 激活或失活(参阅实验步骤中的可选步骤 C)。裂解物随后使用谷胱甘肽树脂和 GST-RalGDS-RBD(泳道 2 和 3)进行孵育。以谷胱甘肽树脂作为阴性对照(泳道 4),已经 GTPγS 处理的裂解物也不用 GST-RalGDS-RBD 进行孵育。使用 Rap1 Rabbit Antibody 对细胞裂解物(20 µg,泳道 1)或 20 µl 洗脱样品(泳道 2、3 和 4)进行蛋白质印迹分析。Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。依次使用 1X LumiGLO®试剂和过氧化物(20X LumiGLO® Reagent 和 20X Peroxide #7003)并随后暴露在 x 射线胶片下来进行检测。

购买 # 8818S
产品货号 规格 价格 库存
8818S
1 个试剂盒(30 次反应)

产品包括 数量(计数) 保存温度
GST-RalGDS-RBD 1 x 600 µg -80°C
GDP 1 x 50 µl -80°C
GTP γS 1 x 50 µl -80°C
Rap1 Rabbit mAb 1 x 50 µl -20°C
Glutathione Resin 1 x 3 ml 4°C
SDS Sample Buffer 1 x 1.5 ml 4°C
Lysis/Binding/Wash Buffer 1 x 100 ml 4°C
Spin Cup and Collection Tubes 1 x 30 ea RT

保存

GTPγS:保存在 -80°C 下 GDP:保存在 -80°C 下 GST-RalGDS-RBD:保存在 -80°C 下 裂解/结合/洗涤缓冲液:保存在 4°C 下 谷胱甘肽树脂:保存在 4°C 下 SDS 样品缓冲液:保存在 4°C 下 旋转杯和采样管:保存在 4°C 下 Rap1 Rabbit mAb:保存在 4°C 下

产品说明

Active Rap1 Detection Kit 提供了检测细胞中激活 Rap1 GTP 酶所必需的所有试剂。GST-RalGDS-RBD 融合蛋白用于结合活化形式的 GTP 结合 Rap1,GTP 结合 Rap1 随后可用谷胱甘肽树脂进行免疫沉淀。随后使用 Rap1 Rabbit Antibody 进行蛋白质印迹实验来确定 Rap1 的激活水平。

特异性/敏感性

Active Rap1 Detection Kit 可检测内源水平的 GTP 结合(活化)Rap1,如图 1 所示。经内部测试确定,该试剂盒可检测规定物种中的蛋白,但也可能检测其他物种的同源蛋白。

背景

小 GTP 结合蛋白(G 蛋白)Ras 超家族包含一大类蛋白(超过 150 个成员),根据它们的序列和功能相似性,可分为至少五个家族:Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran (1-3)。这些小 G 蛋白均有 GDP/GTP 结合及 GTP 酶活性,并在各种细胞和发育活动中作为双向转换器发挥作用,这些活动包括细胞周期进程、细胞存活、肌动蛋白细胞骨架组织、细胞极性和运动以及囊泡和胞核转运 (1)。上游信号会刺激 GDP 结合形式(失活)解离 GDP,导致 GTP 结合及 GTP 结合形式(活化)的形成。活化 G 蛋白随后在其下游效应子结合区域发生构象变化,从而结合并调节下游效应子。固有 GTP 酶活性会阻断这种激活,使 GTP 水解成 GDP 并释放下游效应子。Ras 超家族蛋白的这些固有鸟嘌呤核苷酸交换和 GTP 水解活性还受鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 的调控,GEF 会促进活化 GTP 结合形式和 GTP 酶激活蛋白 (GAP) 的形成,从而将 GTP 酶还原成失活的 GDP 结合形式 (4)。

Rap1 和 Rap2 属于小 GTP 酶 Ras 亚家族,整合素、受体酪氨酸激酶 (RTK)、G 蛋白偶联受体 (GPCR)、死亡结构域相关受体 (DD-R) 和离子通道等各种刺激因素都会激活 Rap1 和 Rap2 (5,6)。与其他小 GTP 酶一样,Rap 活性受鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 刺激,并且 GTP 酶激活蛋白 (GAP) 会使 Rap 失活。现已发现许多 Rap GEF:C3G 通过 Crk 等接头蛋白将 Rap1 与 RTK 连接在一起;Epac(或 cAMP-GEF)传输来自 cAMP 的信号;CD-GEF(或 CalDAG-GEF)传输来自 Ca2+ 或 DAG 或两者的信号 (5)。Rap1 主要调节多个整合素依赖的进程,例如形态发生、细胞间黏附、血细胞生成、白细胞迁移和肿瘤浸润 (5,6)。Rap1 还可通过 B-Raf、PI3K、RalGEF 和磷脂酶 (PLC) 等下游效应子调节细胞增殖、分化和存活 (5-8)。Rap1 和 Rap2 在发挥重叠但不同功能时并不会出现功能冗余现象 (9)。最近的研究指出,Rap2 能调节 Dsh 亚细胞定位,并且早期发育中的 Wnt 信号转导需要 Rap2 (10)。

  1. Takai, Y. et al. (2001) Physiol Rev 81, 153-208.
  2. Colicelli, J. (2004) Sci STKE 2004, RE13.
  3. Wennerberg, K. et al. (2005) J Cell Sci 118, 843-6.
  4. Vigil, D. et al. (2010) Nat Rev Cancer 10, 842-57.
  5. Bos, J.L. et al. (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2, 369-77.
  6. Caron, E. (2003) J Cell Sci 116, 435-40.
  7. Song, C. et al. (2002) Oncogene 21, 8105-13.
  8. Rong, R. et al. (2003) J Biol Chem 278, 52497-503.
  9. Taira, K. et al. (2004) J Biol Chem 279, 49488-96.
  10. Choi, S.C. and Han, J.K. (2005) EMBO J 24, 985-96.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。
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LumiGLO 是 Kirkegaard & Perry Laboratories 的注册商标。
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