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8819
Active Cdc42 Detection Kit
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Active Cdc42 Detection Kit #8819

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Active Cdc42 Detection Kit: Image 1
图 2. 如图所示，GTP 结合 GTP 酶沉淀过程可分为 3 个步骤。步骤 1：在旋转杯中混合样品、结合蛋白和谷胱甘肽树脂，并在 4ºC 下孵育，以使 GTP 结合的 GTP 酶通过 GST 连接的结合蛋白与谷胱甘肽树脂结合。步骤 2：通过离心分离去除未结合的蛋白。步骤 3：用 SDS 缓冲液洗脱结合谷胱甘肽树脂的 GTP 酶。洗脱样品随后通过蛋白质印迹实验进行分析。
Active Cdc42 Detection Kit: Image 2
图 1. NIH/3T3 细胞裂解物（500 µl，1 mg/ml）用 GTPγS 或 GDP 进行体外处理，以使 Cdc42 激活或失活（参阅实验步骤中的可选步骤 C）。裂解物随后与谷胱甘肽树脂和 GST-PAK1-PBD（泳道 2 和 3）进行孵育。以谷胱甘肽树脂作为阴性对照（泳道 4），已经 GTPγS 处理的裂解物，在不含GST-PAK1-PBD的情况下， 也进行孵育。使用 Cdc42 Mouse mAb 对细胞裂解物（20 µg，泳道 1）或 20 µl 洗脱样品（泳道 2、3 和 4）进行蛋白质印迹分析。Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076 用作二抗。
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目录# 规格 价格 库存
8819S		 1 个试剂盒（30 次免疫沉淀）

定制制剂

产品包括 数量（计数） 保存温度
GST-Human PAK1-PBD 1 x 600 µg -20°C
Cdc42 Mouse mAb 1 x 300 µl -20°C
GDP 1 x 50 µl -80°C
GTP γS 1 x 50 µl -80°C
Glutathione Resin 1 x 3 ml +4°C
SDS Sample Buffer 1 x 1.5 ml +4°C
Lysis/Binding/Wash Buffer 1 x 100 ml +4°C
Spin Cup and Collection Tubes 1 x 30 ea RT

保存

GTPγS：-80°C 下储存
GDP：-80°C 下储存
GST-Human PAK1-PBD：-20°C 下储存
Cdc42 Mouse mAb：-20°C 下储存
裂解/结合/洗涤缓冲液：4°C 下储存
谷胱甘肽树脂：4°C 下储存
SDS 样品缓冲液：4°C 下储存
旋转杯和收集管：在室温下储存

实验步骤

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#8819 Active Cdc42 Detection Kit Protocol

需要附加材料

  • Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) #8553
  • Blue Loading Buffer Pack #7722
  • Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) #9997
  • 一抗稀释缓冲液：1X TBST 5% BSA
  • Bovine Serum Albumin (BSA) #9998
  • Nonfat Dry Milk #9999
  • Color-coded Prestained Protein Marker, Broad Range (10-250 kDa) #74124
  • Biotinylated Protein Ladder Detection Pack #7727
  • Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076
  • 20X LumiGLO® Reagent and 20X Peroxide #7003
  • 0.5 M EDTA, pH 8.0 #7011
  • 1 M MgCl2

A. 溶液与试剂

  • 注意：用 ddH2O/等效纯净水制备溶液。
  • 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)
  • 1X 细胞裂解/结合/洗涤缓冲液
  • 注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF。

B. 细胞裂解

  1. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。对于非粘附细胞，于 100xg 沉淀细胞 5 min，细胞重悬于 10 ml 冰冷 PBS。
  2. 去除 PBS 并且将 0.5 ml 冰冷 1X 裂解/结合/洗涤缓冲液加上 1 mM PMSF 添加至每个孔板（10 cm 直径），或 75cm2 烧瓶的细胞沉淀物（约 1-2 x 107 细胞）。
  3. 从平板刮下细胞并转移至适当的试管。对于非粘附细胞，仅重新悬浮沉淀物。
  4. 短暂涡旋试管，在冰上孵育 5 min。
  5. 在 4°C，在 16,000xg 条件下，微量离心 15 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。建议使用新鲜细胞裂解物进行 GTPase 测定。可使用 BCA 蛋白检测确定裂解物蛋白浓度。

    6. 注意：我们建议在在 1X 裂解/结合/洗涤缓冲液中制备 1 mg/ml 裂解物，以进行以下步骤。

C. 体外 GTPγs 或 GDP 处理（可选）

执行以下处理，GTPγs（阳性对照）和 GDP（阴性对照），确保免疫沉淀程序正常开展。每次处理使用 500 µg 细胞裂解物。为获得最佳结果，第一次使用时分装 GTPγs 和 GDP 可以最大程度降低冻融次数。

  1. 对于 500 µl 裂解物，添加 10 µl 0.5 M EDTA pH 8.0 （最终浓度为 10 mM），涡旋样本。
  2. 添加 5 µl 的 10 mM GTPγS（最终浓度为 0.1 mM）或 5 µl 100 mm GDP（最终浓度为 1 mm），涡旋样本。
  3. 在 30°C 不断搅动下培养混合物 15 min。
  4. 将样本放在冰上并添加 32 µl 1 m MgCl2（最终浓度为 60 mM），涡旋样本。

D. 激活 G 蛋白的亲和沉淀物

  1. 将旋杯插入每个样本的收集管。
  2. 旋转一瓶谷胱甘肽树脂，充分重悬琼脂糖微球 。用采集管向旋杯添加 100 µl 的 50% 树脂砂浆。以 6,000xg 离心管 10-30 秒
  3. 丢弃流出液。添加 400 µl 1X 裂解/结合/洗涤缓冲液以及树脂至旋杯轻轻倒置试管。以 6,000xg 离心管 10-30 秒丢弃流出液。
  4. 在冰上解冻 GST-PAK1-PBD 。如果存在沉淀物，则以 6000 g 的离心力对试管离心分离 10-30 秒钟。取出上清液，立即分装为 20 µg 样本。在 -80°C 下储存等分试样，以便稍后使用。注意：由于这种蛋白质的性质，预计存在沉淀情况，并且不会影响性能。
  5. 添加 20 µg GST-PAK1-PBD 到含有谷胱甘肽树脂的旋杯。
  6. 立即转移最多 700 µl 细胞裂解物（至少 500 µg总蛋白质）至旋杯，盖上盖子，涡旋样品。
  7. 用实验室薄膜密封收集管的盖，防止泄漏，可能由裂解物中的洗涤剂存在而导致，涡旋样品。
  8. 轻柔震荡下，在 4°C 孵育反应混合物小时。
  9. 以 6,000xg 的离心旋杯和收集管 10-30 秒
  10. 取下实验室膜并将旋杯转移到新收集管。
  11. 清洗树脂，添加 400 µl 1X 细胞裂解/结合/洗涤缓冲液，倒置试管三次，并以 6,000xg 离心 10-30 秒。丢弃缓冲液。再次重复此洗涤步骤两次。
  12. 将旋杯转移到新收集管。
  13. 通过将二硫苏糖醇 (DTT) 加入 2X SDS 样品缓冲液至终浓度为 200 mM，为每个下级反应制备50 µl 还原样品缓冲液。
  14. 添加 50 µl 2x 还原样品缓冲液至树脂。将样品涡旋并在室温下孵育 2 min。
  15. 以 6,000xg 离心试管 2 min。取下并丢弃含有树脂的旋杯。
  16. 将洗脱样品加热到 95–100°C，并持续 5 分钟。样品可在凝胶上进行电泳或在 -20°C 下储存，以供将来使用。

E. 蛋白质印迹分析

    注意：容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整容量。

  1. 上样 20-25 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    2. 注意：CST 建议上样预染色的分子量标记物（#74124，10 µl/泳道），以验证电转移和生物素化蛋白梯（#7727，10 µl/泳道），从而确定分子量。4-20％丙烯酰胺或 Tris-甘氨酸凝胶可提供最佳分离效果。

  2. 电转移至硝酸纤维素膜。
  3. 转移之后，在室温下用 25 ml TBST 将硝酸纤维素膜洗涤 5 min。
  4. 在室温下，将膜在25 ml 的封闭缓冲液（含有0.1% Tween-20 和5%BSA 的 TBS）中孵育 1 小时。
  5. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  6. 将膜与 Cdc42 Mouse mAb（1：167稀释）在10 ml 一抗稀释液中孵育，并在 4°C 轻轻搅拌过夜。
  7. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  8. 将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (1:2000, #7076) 和 HRP-conjugated anti-biotin antibody (1:1000, #7075) 放在 10 ml 含 5% 牛奶的 1X TBST 中室温孵育 1 小时，轻轻搅动，以检测生物素化的蛋白标记物。
  9. 用 15 ml 1X TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  10. 将膜与 10 ml LumiGLO®（0.5 ml 20X LumiGLO®, 0.5 ml 20X Peroxide、#7003和 9.0 ml ddH20 水）放在室温下孵育 1 分钟，轻轻搅动。

    11. 注：如果信号反应太快，则可进一步稀释 LumiGLO® 底物。

  11. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用光胶片曝光。初始曝光时间 10 秒，来提示适当的曝光时间。

    12. 注：由于检测反应的动力学，信号在 LumiGLO® 孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。

LumiGLO® 是 Kirkegaard & Perry Laboratories 的注册商标。

发布​时间 2020 年 6 月

实验步骤编号：2046

产品说明

Active Cdc42 Detection Kit 提供了检测细胞中激活 Cdc42 GTP 酶所必需的所有试剂。GST-PAK1-PBD 融合蛋白用于结合 GTP - Cdc42 的激活形式，随后与谷胱甘肽树脂进行免疫沉淀。使用 Cdc42 Mouse mAb 进行蛋白质印迹实验来确定 Cdc42 的激活水平。

特异性/灵敏度

Active Cdc42 Detection Kit 可检测内源水平的 GTP –结合（活化）Cdc42，如图 1 所示。经内部测试确定，该试剂盒可检测规定物种中的蛋白，但也可能检测其他物种的同源蛋白。

物种反应性：

人, 小鼠

背景

小 GTP 结合蛋白（G 蛋白）Ras 超家族包含一大类蛋白（超过 150 个成员），根据它们的序列和功能相似性，可分为至少五个家族：Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran（1-3）。这些小 G 蛋白均有 GDP/GTP 结合及 GTP 酶活性，并在各种细胞和发育活动中作为双向转换器发挥作用，这些活动包括细胞周期进程、细胞存活、肌动蛋白细胞骨架组织、细胞极性和运动以及囊泡和胞核转运 (1)。上游信号会刺激 GDP 结合形式（失活）解离 GDP，导致 GTP 结合及 GTP 结合形式（活化）的形成。活化 G 蛋白随后在其下游效应子结合区域发生构象变化，从而结合并调节下游效应子。固有 GTP 酶活性会阻断这种激活，使 GTP 水解成 GDP 并释放下游效应子。Ras 超家族蛋白的这些固有鸟嘌呤核苷酸交换和 GTP 水解活性还受鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 的调控，GEF 会促进活化 GTP 结合形式和 GTP 酶激活蛋白 (GAP) 的形成，从而将 GTP 酶还原成失活的 GDP 结合形式 (4)。
Rac 和 Cdc42 蛋白是 Rho-GTPase 家族成员。在哺乳动物中，Rac 有三个序列高度相似的同工型：Rac1、Rac2 和 Rac3。Rac1 和 Cdc42 是这个家族中研究最广泛的成员，它们普遍表达。Rac2 蛋白在造血起源的细胞中表达，在脑中高表达的 Rac3 蛋白也在其他许多组织中被发现。Rac 和 Cdc42 在细胞骨架重组、膜转运、转录调节、细胞生长和发育中发挥关键的信号转导作用 (5)。GTP 结合刺激 Rac/Cdc42 蛋白的活性，然而通过蛋白质内部 GTPase 活性促使 GTP 水解成 GDP，致使它失活。GTPase 激活蛋白 (GAPs) 可辅助 GTP的水解，而鸟嘌呤核苷交换因子 (GEF) 可促进 GDP 转换为 GTP。通过鸟苷酸解离抑制剂 (RhoGDI) 的结合达到另一个调节的水平，这会保留包括 Rac 和 Cdc42 在内的 Rho 家族 GTPases 处于失活的 GDP 结合状态 (6,7)。
  1. Takai, Y. et al. (2001) Physiol Rev 81, 153-208.
  2. Colicelli, J. (2004) Sci STKE 2004, RE13.
  3. Wennerberg, K. et al. (2005) J Cell Sci 118, 843-6.
  4. Vigil, D. et al. (2010) Nat Rev Cancer 10, 842-57.
  5. Wennerberg, K. and Der, C.J. (2004) J Cell Sci 117, 1301-12.
  6. Bernards, A. and Settleman, J. (2004) Trends Cell Biol 14, 377-85.
  7. Rossman, K.L. et al. (2005) Nat Rev Mol Cell Biol 6, 167-80.

通路与蛋白质

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