产品包括 | 数量(计数) | 保存温度 | |||
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GST-Human PAK1-PBD | 1 x 600 µg | -20°C | |||
Cdc42 Mouse mAb | 1 x 300 µl | -20°C | |||
GDP | 1 x 50 µl | -80°C | |||
GTP γS | 1 x 50 µl | -80°C | |||
Glutathione Resin | 1 x 3 ml | +4°C | |||
SDS Sample Buffer | 1 x 1.5 ml | +4°C | |||
Lysis/Binding/Wash Buffer | 1 x 100 ml | +4°C | |||
Spin Cup and Collection Tubes | 1 x 30 ea | RT |
产品信息
注意:我们建议在在 1X 裂解/结合/洗涤缓冲液中制备 1 mg/ml 裂解物,以进行以下步骤。
执行以下处理,GTPγs(阳性对照)和 GDP(阴性对照),确保免疫沉淀程序正常开展。每次处理使用 500 µg 细胞裂解物。为获得最佳结果,第一次使用时分装 GTPγs 和 GDP 可以最大程度降低冻融次数。
注意:容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整容量。
注意:CST 建议上样预染色的分子量标记物(#74124,10 µl/泳道),以验证电转移和生物素化蛋白梯(#7727,10 µl/泳道),从而确定分子量。4-20%丙烯酰胺或 Tris-甘氨酸凝胶可提供最佳分离效果。
注:如果信号反应太快,则可进一步稀释 LumiGLO® 底物。
注:由于检测反应的动力学,信号在 LumiGLO® 孵育后最强并且在后续 2 小时内减弱。
LumiGLO® 是 Kirkegaard & Perry Laboratories 的注册商标。
发布时间 2020 年 6 月
实验步骤编号:2046
人, 小鼠
小 GTP 结合蛋白(G 蛋白)Ras 超家族包含一大类蛋白(超过 150 个成员),根据它们的序列和功能相似性,可分为至少五个家族:Ras、Rho、Rab、Arf 和 Ran (1-3)。这些小 G 蛋白均有 GDP/GTP 结合及 GTP 酶活性,并在各种细胞和发育活动中作为双向转换器发挥作用,这些活动包括细胞周期进程、细胞存活、肌动蛋白细胞骨架组织、细胞极性和运动以及囊泡和胞核转运 (1)。上游信号会刺激 GDP 结合形式(失活)解离 GDP,导致 GTP 结合及 GTP 结合形式(活化)的形成。活化 G 蛋白随后在其下游效应子结合区域发生构象变化,从而结合并调节下游效应子。固有 GTP 酶活性会阻断这种激活,使 GTP 水解成 GDP 并释放下游效应子。Ras 超家族蛋白的这些固有鸟嘌呤核苷酸交换和 GTP 水解活性还受鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 的调控,GEF 会促进活化 GTP 结合形式和 GTP 酶激活蛋白 (GAP) 的形成,从而将 GTP 酶还原成失活的 GDP 结合形式 (4)。
Rac 和 Cdc42 蛋白是 Rho-GTPase 家族成员。在哺乳动物中,Rac 有三个序列高度相似的同工型:Rac1、Rac2 和 Rac3。Rac1 和 Cdc42 是这个家族中研究最广泛的成员,它们普遍表达。Rac2 蛋白在造血起源的细胞中表达,在脑中高表达的 Rac3 蛋白也在其他许多组织中被发现。Rac 和 Cdc42 在细胞骨架重组、膜转运、转录调节、细胞生长和发育中发挥关键的信号转导作用 (5)。GTP 结合刺激 Rac/Cdc42 蛋白的活性,然而通过蛋白质内部 GTPase 活性促使 GTP 水解成 GDP,致使它失活。GTPase 激活蛋白 (GAPs) 可辅助 GTP的水解,而鸟嘌呤核苷交换因子 (GEF) 可促进 GDP 转换为 GTP。通过鸟苷酸解离抑制剂 (RhoGDI) 的结合达到另一个调节的水平,这会保留包括 Rac 和 Cdc42 在内的 Rho 家族 GTPases 处于失活的 GDP 结合状态 (6,7)。
探索与本品相关的通路。
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