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72782
7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit
细胞检测试剂盒
检测试剂盒

7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit #72782

引用 (0)
Flow Cytometry Image 1: 7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit

流式细胞术分析用 CFSE 标记的 K562 细胞(顶行)或 SUP-B15 细胞(下排),以 a12:1 的效应器:目标细胞比值带(右栏)或不带(左栏)效应器 NK-92 细胞的情况下孵育4小时,并用 7-AAD 染色15分钟。7-AAD 和 CFSE 染色阳性的细胞代表死亡靶细胞,位于点图的 Q2 中。

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72782S
1 个试剂盒(100 次检测)

产品包括 数量(计数) 溶液颜色
7-AAD Viability Dye 2 x 50 µl
CFSE Stock Solution 1 x 100 µl
Cell-Based Assay Buffer Tablet 1 x 4 ea

实验步骤

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#72782 7-AAD/CFSE 细胞介导的细胞毒性检测试剂盒

A. 溶液和试剂

提供的试剂:

  1. 基于细胞的检测缓冲液: 将每种基于细胞的检测缓冲液片剂(#27868 )溶解在 100 ml 反渗透去离子(RODI)水中。充分混合以确保片剂溶解。稀释的缓冲液在室温下可稳定一年。
  2. 7-AAD 活性染料: 将 10μl7-AAD 活性染料(1,000X)(#89587 )添加到 10 ml 基于细胞的检测缓冲液中,并充分混合。
  3. CFSE 染色溶液: 首先,通过向 10 ml的基于细胞的测定缓冲液中添加10 mg BSA,制备 0.1% BSA/检测缓冲液。然后在 0.1% BSA/检测缓冲液中以 1:500 的比例稀释 CFSE 储备溶液(#16650)并充分混合。每10 7细胞需要 1 ml CFSE 染色溶液。

  4. 注意:推荐的实验步骤使用 CFSE 标记细胞,使其足够明亮以区分标记和未标记的细胞,但又模糊到不渗入其他通道。但是,如果需要更亮的染色,则可以从 CFSE 染色溶液制备中省略 BSA。

其他试剂(未提供):

  1. Bovine Serum Albumin (BSA) (#9998)

B. 靶细胞标记

注意:正确分析数据,需要以下对照目标细胞组来设置流式细胞仪和补偿:

  • 未染色靶细胞
  • 针对每个标签或染色的单染靶细胞

  1. 获取靶细胞用于细胞毒性检测。该检测的最佳条件和孵育时间应根据个别情况确定。
  2. 以 400 x g 离心细胞五分钟。吸出上清液并轻拂试管以使沉淀物破裂。
  3. 将细胞沉淀物以 107 细胞/ml 的浓度快速重悬于 CFSE 染色液(按溶液和试剂中所述制备)中。应当尽快达到均匀的悬浮液,因为几乎立即吸收 CFSE,并且 CFSE 浓度的局部变化会影响染色的均匀性。对照靶细胞(不含 CFSE 的靶细胞)应重悬在 0.1% BSA/检测缓冲液。
  4. 将细胞在 CFSE 染色液中于 37°C 下孵育 15 分钟。
  5. 加入至少 10 体积的含 FBS 的培养基。将靶细胞以 400 x g 离心五分钟。
  6. 抽吸上清液。
  7. 将靶细胞重悬于 10 ml培养基中。
  8. 将靶细胞以 400 x g 离心五分钟。
  9. 抽吸上清液。
  10. 以 105 细胞/ml 的浓度将靶细胞重悬于培养基中。
  11. 在 37°C 下将细胞在 CO2 培养箱中培养 30 分钟或更长时间(但时间不足以使细胞增殖)。

C. 检测流程

  1. 将效应细胞收集到试管中。以 400 x g 离心细胞 五分钟以进行沉淀。
  2. 以 5106 细胞/ml 的浓度将细胞重悬于培养基中。
  3. 以预定的效应器/靶细胞比率将效应细胞添加到 CFSE 标记的靶细胞悬浮液中。下表显示了一些示例:

    效应器:靶细胞比率 效应细胞悬浮液 靶细胞悬浮液 靶细胞培养基 最终体积
    0 0 ml 1.5 ml 0 ml 1.5 ml
    6.25:1 0.125 ml 1 ml 0.375 ml 1.5 ml
    12.5:1 0.25 ml 1 ml 0.25 ml 1.5 ml
    25:1 0.5 ml 1 ml 0 ml 1.5 ml
  4. 根据您的最佳方案,将细胞混合物培养 4 小时或一段时间,以便有足够的时间进行细胞溶解活动。
  5. 如本文所述,在96孔 v 底板中染色,将细胞移入板中,并在 400 x g下离心 5 分钟。(对于试管中的染色,将体积放大 5 倍)。
  6. 抽吸上清液。

    注意:如果要检测其他表面标记,可以在实验步骤中于此时插入染色。

  7. 将细胞重悬于 200 μl7-AAD 活性染料(按照“溶液和试剂”中所述进行制备)并充分混合。对照靶细胞(不含 CFSE 或 7-AAD 活性染料的靶细胞或仅具有 CFSE 染色的靶细胞)应重悬于200 μl 检测缓冲液中。
  8. 在黑暗中于 4°C 下孵育细胞 15 分钟。
  9. 现在可以使用流式细胞仪进行细胞分析了,应该立即进行分析。开启 CFSE+ 靶细胞(ex/em 488 / 525),然后通过 7-AAD 排除(ex/em 488 / 647)可视化活/死细胞百分比。

D. 疑难解答


问题 可能的原因 推荐溶液
CFSE 的低信号
  1. 细胞不健康
  2. CFSE 未对细胞进行正确标记
  1. 仅使用健康细胞
  2. 进行 CFSE 滴定以获得 CFSE 染色的最佳浓度
不同效应细胞与靶细胞比率之间的细胞毒性无差异
  1. 靶细胞不健康
  2. 效应细胞不会导致细胞毒性
  1. 仅使用健康靶细胞
  2. 使用导致细胞毒性的效应细胞

发布​于 2020 年 2 月 

实验步骤编号:1964

产品说明

7-AAD/CFSE 细胞介导的细胞毒性测定试剂盒使用 CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)标记混合细胞群中的靶细胞,并使用 7-AAD(7-氨基放线菌素 D)标记死细胞。该试剂盒相对于传统的铬 51(51 Cr)释放测定法进行了改进,以评估细胞介导的细胞毒性。CFSE 标记更敏感,不使用放射性同位素,可使用流式细胞仪在单细胞水平上评估溶胞溶解。

背景

通常使用细胞溶解测定法来查询免疫效应细胞的功能。为了在效应细胞和靶细胞的异种细胞群中查询免疫效应细胞的细胞溶解活性,必须能够区分具有不同表型的效应细胞和靶细胞群。这样,该试剂盒设计为在与未标记的效应细胞共培养之前,用膜可渗透的荧光染料 CFSE 标记活的靶细胞,从而使活的效应物和靶细胞之间清晰分离。孵育活的效应细胞和靶细胞后,添加 DNA 嵌入染料 7-AAD,以标记带有受损质膜的垂死靶细胞。通过使用具有不同光谱特性的染料,可以使用流式细胞术在四个细胞群之间实现清晰的分离:活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞(1)。

  1. Kim, G.G. et al. (2007) J Immunol Methods 325, 51-66.

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