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2834
Phospho-Bcl-2 (Ser70) (5H2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
抗体偶联物
单克隆抗体

Phospho-Bcl-2 (Ser70) (5H2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #2834

引用 (1)
筛选器:
  1. F
Flow Cytometry Image 1: Phospho-Bcl-2 (Ser70) (5H2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
以碘化丙啶作为对照,使用 Phospho-Bcl-2 (Ser70) (5H2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 对未经处理(上图)或已经紫杉醇(下图)处理的 Jurkat 细胞进行流式细胞分析(DNA 含量)。蓝色插图表示单独的碘化丙啶染色,表明经紫杉醇处理的样品发生细胞有丝分裂停滞。
To Purchase # 2834S
目录# 规格 价格 库存
2834S
100 µl (50 次检测)

支持性数据

反应性 H
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种偶联 Alexa Fluor® 488 荧光染料的抗体,经内部测试可用于人细胞的直接流式细胞分析。

产品使用信息

应用 稀释度
流式细胞术(固定/通透) 1:50

保存

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。4°C 保存。切勿分装抗体。避光。切勿冷冻。

实验步骤

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流式细胞术,针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者,细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时,向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度,使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离,以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。避光。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:407

特异性/灵敏度

仅当 Bcl-2 在 Ser70 位点被磷酸化时,Phospho-Bcl-2 (Ser70) (5H2) Rabbit mAb 才可检测出内源水平的 Bcl-2 。该抗体不会与相应内源水平的非磷酸化 Bcl-2 或其他 Bcl-2 家族成员发生交叉反应。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 Bcl-2 中 Ser70 周围的残基相对应的合成磷酸肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。该抗体在最合适的条件下接合 Alexa Fluor® 488,其中 F/P 比值为 2-6。

背景

在各种凋亡刺激下,Bcl-2 通过抑制线粒体细胞色素 c 的释放而发挥存活功能 (1)。它与线粒体钙稳态和质子流的调节有关 (2)。目前在 Bcl-2 中发现了多个磷酸化位点,包括 Thr56、Ser70、Thr74 和 Ser87 (3)。研究表明,这些磷酸化位点可能是 ASK1/MKK7/JNK1 通路的靶标,并且 Bcl-2 的磷酸化可能是有丝分裂活动的一个标志 (4,5)。在糖皮质激素诱导 T 淋巴细胞凋亡期间,Bcl-2 的 Thr56 或 Ser87 位点突变会抑制其抗凋亡活性 (6)。白介素 3 和 JNK 诱导的 Bcl-2 在 Ser70 位点磷酸化,可能对增强抗凋亡作用至关重要 (7)。
  1. Murphy, K.M. et al. (2000) Cell Death Differ 7, 102-11.
  2. Zhu, L. et al. (1999) J Biol Chem 274, 33267-73.
  3. Maundrell, K. et al. (1997) J Biol Chem 272, 25238-42.
  4. Yamamoto, K. et al. (1999) Mol Cell Biol 19, 8469-78.
  5. Ling, Y.H. et al. (1998) J Biol Chem 273, 18984-91.
  6. Huang, S.T. and Cidlowski, J.A. (2002) FASEB J 16, 825-32.
  7. Deng, X. et al. (2001) J Biol Chem 276, 23681-8.

通路与蛋白质

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限制使用

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
本产品中的 Alexa Fluor 染料偶联抗体经 Life Technologies Corporation 许可销售,仅供研究使用,不可与 DNA 微阵列结合使用。Alexa Fluor430® 染料(除 Alexa Fluor® 染料外)是待审批的授权专利。Alexa Fluor® 是 Molecular Probes, Inc 的注册商标。
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