Phospho-Akt (Ser473) (587F11) Mouse mAb (Biotinylated) #5102

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于天然蛋白质免疫沉淀法，进行蛋白质免疫印迹分析或激酶活动分析。

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O 中并混合。

2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH₂O，并混合。

   注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3. 3X SDS上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
4. Streptavidin (Sepharose^® Bead Conjugate)（针对生物素化抗体）：(#3419) 轻轻涡旋小瓶，每次免疫沉淀使用 10 µl。
5. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH₂O 中并混合。
6. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（可选）

1. 添加 10 µl Streptavidin (Sepharose^® Bead Conjugate)（#3419；针对生物素化抗体）到 200 µl 浓度为 1 mg/ml 的细胞裂解物中。
2. 在 4°C 下，旋转孵育 30–60 分钟。
3. 4°C 条件下微量离心 10 分钟。将上清转移到新管中。
4. 继续以下的免疫沉淀法。

免疫沉淀法

1. 将生物素化抗体（按产品数据表中推荐的合适稀释比例配制）加入到 200 µl 细胞裂解物中，浓度取 1 mg/ml。在 4°C 下，旋转孵育过夜。
2. 轻轻混合 Streptavidin (Sepharose^® Bead Conjugate) (#3419)，并添加 10 µl 珠浆。在 4°C 下，旋转孵育 2 小时。
3. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
4. 继续使用蛋白免疫印迹法或激酶活性检测对样品进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物。涡旋振荡，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 30 秒。
2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
3. 对于 SDS-PAGE，将样品 (15–30 µl) 上样至 4–20% 凝胶上。
4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：当使用兔产生的一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）作为二抗，以尽量减少变性兔子重链产生的干扰。对于分子量大约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127），以尽量减少变性小鼠重链或轻链产生的干扰。

当使用鼠源一抗检测分子量在 50 kDa 范围内的蛋白质时，我们建议使用 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) 作为二抗，以尽量减少变性小鼠重链产生的干扰。

用激酶活性测定法进行分析

1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下微量离心 1 分钟。
7. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE (4–20%) 上。