PD-L1 (D5V3B) Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #33275

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液与试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 二甲苯。
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. 洗涤缓冲液：
   1. 含 Tween^®20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液 (TBST)：要配制 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween^®20 (TBST)(#9997) 的 10 X Tris 盐缓冲液至 900 ml dH₂0 中，混合。
   2. 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要配制 1L 1X PBS，添加 100 ml 10X 洗涤缓冲液、磷酸盐缓冲盐水 (#12528) 到 900 ml dH₂0 中，混合。
5. SignalStain^® Antibody Diluent: (#8112)
6. 1X EDTA 修复液：要配制 250 mL 1X EDTA 修复液，用 225 ml dH₂O 稀释 25 ml SignalStain^® EDTA Unmasking Solution (10X) (#14747)。
7. 3% 过氧化氢：要制备，添加10 ml 30% H₂O₂至90 ml dH₂O 中。
8. 封闭液：1X TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
   1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
   2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备4 mL 的 dH₂O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
9. Prolong^® Gold AntiFade Reagent(#9071)、Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI(#8961)。
10. （可选）TrueBlack^® Lipofuscin Autofluorescence Quencher (#92401)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

1. 在微波炉中加热浸于 1X EDTA 修复液的切片直至开始沸腾为止；继而在亚沸腾温度 (95^°-98^°) 持续 15 分钟。无需冷却。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 在 1X TBST 中孵育切片 5 分钟。
3. 在每个切片上滴加 100–400 µl 首选封闭液，在室温下封闭 1 小时。
4. 移除封闭液，并向每张切片添加稀释于 SignalStain^® Antibody Diluent 中的 100-400 µl 一抗。
5. 在 4^°C 过夜孵育。
6. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。
   注：请参阅下文，了解可选的 TrueBlack^® 脂褐素自发荧光淬灭剂实验步骤。
7. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent 或 Prolong^® Gold Antifade Reagent with DAPI，用盖玻片盖住切片。
8. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。为长期储存，将切片在 4^°C 避光平放储存。

TrueBlack^® 脂褐素自发荧光猝灭剂实验步骤

按照 D 部分步骤 6：

重要提示：TrueBlack^® 脂褐素自发荧光猝灭剂与去垢剂不兼容。任何涉及去垢剂的步骤必须在施加 TrueBlack^® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 之前完成。

1. 通过在 70% 乙醇中 1:20 稀释来配制 TrueBlack^® Lipofuscin Autofluorescence Quencher 溶液。涡旋混合。注：猝灭液应在用前新鲜配制，且若沉淀物可见则丢弃。我们建议在稀释前将装有 TrueBlack^® 脂褐素自发荧光猝灭剂的 20X DMF 原液加热至 70^°，以免形成沉淀物。
2. 立即用 100 µL - 200 µL 猝灭溶液在室温覆盖组织切片 30 秒。重要提示：请勿让切片干透。切片可以耐受更长的孵育（长达 3 分钟），只要它们保持水化即可。
3. 在转移到 1X PBS 之前，在吸水毛巾上轻拍切片以归集多余 TrueBlack^® 脂褐素自发荧光猝灭剂。
4. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
5. 继续进行复染/封片。