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8834
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb (Biotinylated)
偶联抗体
单克隆抗体

E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb (Biotinylated) #8834

引用 (4)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb (Biotinylated)

使用 E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb (Biotinylated) 对 MCF7 和 Hela 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。Streptavidin-HRP #3999 用于检测。

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8834S
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支持数据

反应性 H M
敏感性 内源性
MW (kDa) 135
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体在最合适的条件下偶联生物素。该生物素化抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb #3195 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 136 mM NaCl、2.6 mM KCI、12 mM 磷酸氢二钠(pH 为 7.4)、2 mg/ml BSA 和 50 % 甘油中。存储温度为 -20℃。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. Streptavidin-HRP:(#3999)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Streptavidin-HRP (#3999 以适宜的稀释度)在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:266

特异性/敏感性

E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb (Biotinylated) 可检测内源水平的内皮钙粘素总蛋白。该抗体不与相关家族成员发生交叉反应,例如 N-cadherin。

物种反应性:

人, 小鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

牛 , 犬 , 猪

来源/纯化

使用与人 E-cadherin 蛋白 Pro780 周围的序列相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

钙黏着蛋白是在其胞外结构域中含有大约 100 个残基的钙黏着蛋白重复序列的跨膜糖蛋白超家族。钙黏着蛋白介导钙依赖性细胞-细胞黏附,并在正常组织发育中发挥至关重要的作用 (1)。经典的钙黏着蛋白亚家族包括 N-、P-、R-、B- 和 E-钙黏着蛋白,以及约十个在黏附连接中存在的其他成员,黏附连接是一种在极化上皮细胞顶面的细胞结构。经典钙黏着蛋白的胞质结构域可与 β-联蛋白、γ-联蛋白(也称作斑珠蛋白)和 p120 联蛋白相互作用。β-联蛋白和 γ-联蛋白与 α-联蛋白结合, 并且 α-联蛋白将钙黏着蛋白-联蛋白复合体连接至肌动蛋白细胞骨架 (1,2)。β- 和 γ-联蛋白在连接复合体中发挥结构性作用,而 p120 可调节钙黏着蛋白黏附活性和转运 (1-4)。研究者认为 E-钙黏着蛋白是许多上皮癌侵润和生长的活性抑制蛋白 (1-3)。研究表明,除了上皮钙粘素丢失外,癌细胞的神经钙粘素表达上调。钙粘素表达的这种变化被称作“钙粘素转换”。N-钙黏着蛋白与 FGF 受体协作,导致 MMP-9 过表达和细胞侵袭 (3)。研究表明,在内皮细胞中,VE-钙黏着蛋白信号转导、表达和定位与血管通透性和肿瘤血管生成相关 (5,6)。研究者还已经证实,正常情况下在上皮细胞中的存在的 P-钙黏着蛋白,其表达在卵巢和其他人类癌症中也发生改变 (7,8)。

  1. Wheelock, M.J. and Johnson, K.R. (2003) Annu Rev Cell Dev Biol 19, 207-35.
  2. Christofori, G. (2003) EMBO J 22, 2318-23.
  3. Hazan, R.B. et al. (2004) Ann N Y Acad Sci 1014, 155-63.
  4. Bryant, D.M. and Stow, J.L. (2004) Trends Cell Biol 14, 427-34.
  5. Rabascio, C. et al. (2004) Cancer Res 64, 4373-7.
  6. Yamaoka-Tojo, M. et al. (2006) Arterioscler Thromb Vasc Biol 26, 1991-7.
  7. Patel, I.S. et al. (2003) Int J Cancer 106, 172-7.
  8. Sanders, D.S. et al. (2000) J Pathol 190, 526-30.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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