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9654
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (Biotinylated)
偶联抗体
单克隆抗体

Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (Biotinylated) #9654

引用 (34)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (Biotinylated)

使用 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (Biotinylated) ,对未经处理或已经 Staurosporine #9953(1 μM,3 小时)处理的 Hela 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析,并使用 Streptavidin-HRP #3999 进行检测。

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9654S
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支持数据

反应性 H M R Mk
敏感性 内源性
MW (kDa) 17, 19
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体在最合适的条件下偶联生物素。该生物素化抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb #9664 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 136 mM NaCl、2.6 mM KCI、12 mM 磷酸氢二钠(pH 为 7.4)、2 mg/ml BSA 和 50 % 甘油中。存储温度为 -20℃。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. Streptavidin-HRP:(#3999)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Streptavidin-HRP (#3999 以适宜的稀释度)在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:265

特异性/敏感性

Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (Biotinylated) 可检测 Asp175 附近裂解活化产生的内源水平的活化 caspase-3 中大片段 (17/19 kDa)。该抗体无法检测全长 caspase-3 或其他剪切的半胱天冬酶。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠, 猴

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

牛 , 犬 , 猪

来源/纯化

使用与人 caspase-3 Asp175 周围的氨基末端残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Caspase-3 (CPP-32, Apoptain, Yama, SCA-1) 是一个凋亡的关键执行者,因为它对许多关键的蛋白起着部分或全部的裂解作用,比如核酶多聚 (ADP-ribose) 聚合酶 (PARP) (1)。caspase-3 的激活需要经过其未活化的酶原形式转变为活化的 p17 和 p12 片段的蛋白水解过程。caspase-3 的剪切需要位于 P1 位点的天门冬氨酸残基 (2)。

  1. Fernandes-Alnemri, T. et al. (1994) J Biol Chem 269, 30761-4.
  2. Nicholson, D. W. et al. (1995) Nature 376, 37-43.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

限制使用

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