CD69 (H1.2F3) Hamster mAb (PE Conjugate) #90168

直接偶联抗体的流式细胞术 Triton™ X-100 透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂均可与我公司的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Triton™ X-100) #51995 一并高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
3. 细胞透化缓冲液：购买即用型 (#39487) ，或要配制 10 ml，请添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 抗体稀释液。4°C 保存。
4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释液 (#13616)，或要配制 100 ml，请在 100 ml 1X PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998)。4°C 保存。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定与透化

注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

注：如果表位遭甲醛和/或 Triton™ X-100 破坏，则可在固定前添加靶向 CD 标志物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。
5. 在每一百万个细胞约 100 μl 细胞透化缓冲液中重悬细胞。
6. 在室温孵育 10 分钟。
7. 继续进行染色或将细胞在 PBS 中 -4°C 保存过夜。

C. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次检测用 5x10⁵ 至 1x10⁶ 个细胞）。
2. 将细胞离心，弃去清液。
3. 在 100 µl 稀释的抗体偶联物中重悬细胞，抗体偶联物在抗体稀释缓冲液中按建议的或如通过滴定确定的稀释度配制。
4. 室温 (20-25°C) 孵育 1 小时。避光。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 1X PBS 中重悬细胞，在流式细胞分析仪上分析。

流式细胞术，针对直接结合抗体的活细胞实验步骤

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
2. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

注：如果使用全血，则需裂解红血细胞，并在免疫染色之前通过离心分离洗涤。

注：人 Fc 受体与兔 IgG 发生交叉反应。当感兴趣的细胞表达高水平的 Fc 受体蛋白（例如，巨噬细胞/单核细胞谱系）时，在用兔抗体进行免疫染色之前，用人 Fc 块预孵育活细胞。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
5. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。