CD3 (17A2) Rat mAb (redFluor^™ 710 Conjugate) #26582

免疫荧光法（冰冻）

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH₂O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。
5. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 - 冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

1. 冰冻固定组织进行免疫染色（C 部分）。
2. 对新鲜未固定的冰冻组织，请立刻按下列步骤固定：

   1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用。

   2. 室温下固定切片 15 分钟。
   3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次，每次 5 分钟。
   4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭标本时，按照产品网页实验步骤中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
6. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong^® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
7. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

流式细胞术，针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：若要制备 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
2. 4% 甲醛，无甲醇 (#47746)
3. 100% 甲醇 (#13604)：用前冷却
4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

注：固定前，贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

注：如果使用全血，则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

注：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
   1. 或者，细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

1. 通过温和涡旋混合的同时，向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度，使细胞透化。
2. 在冰上透化最短 10 分钟。
3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离，以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 室温孵育 1 小时。避光。
5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上分析。

流式细胞术，针对直接结合抗体的活细胞实验步骤

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

1. 1 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：要配制 1 L 1X PBS：将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水，混合。
2. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

注：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活力指示染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品网页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

注：如果使用全血，则需裂解红血细胞，并在免疫染色之前通过离心分离洗涤。

注：人 Fc 受体与兔 IgG 发生交叉反应。当感兴趣的细胞表达高水平的 Fc 受体蛋白（例如，巨噬细胞/单核细胞谱系）时，在用兔抗体进行免疫染色之前，用人 Fc 块预孵育活细胞。

注：最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。（通常，每次测定 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心使细胞沉淀下来，移除上清液。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
4. 在冰上孵育 30 分钟至 1 小时。避光。
5. 用抗体稀释缓冲液进行离心洗涤。弃去上清液。重复。
6. 在 200-500 μl 抗体稀释缓冲液中重悬细胞后用流式细胞分析仪进行分析。