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30004
Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)
偶联抗体
单克隆抗体

Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #30004

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筛选器:
  1. IF
Immunofluorescence Image 1: Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)

使用 Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb (Alexa Fluor647® Conjugate) (红色)和 Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #40760(绿色)对瞬时转染带 myc 标签的 Cas9 (金黄色葡萄球菌) 表达载体的 HCT 116 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(蓝色)封片。

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30004S
100 µl (50 次测试)

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支持数据

反应性 所有物种
敏感性 转染性
MW (kDa)
来源/亚型 小鼠 IgG2b

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体与 Alexa Fluor® 647 荧光染料接合,并经内部测试,可用于人体细胞的直接免疫荧光分析。该抗体显示的物种交叉反应性预计与非偶联的 Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb #48989 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:50

保存

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。储存在 4°C。不要分装抗体,避光保存,切勿冷冻。

实验步骤

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免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100):要配制 10 ml:添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中,混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液: (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (#9998),并混合。
  5. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意:甲醛有毒性,需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  6. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ,用盖玻片盖住切片。
  7. 要达到最佳效果,使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号:182

特异性/敏感性

Cas9 (S. aureus) (6H4) Mouse mAb (Alexa Fluor® 647Conjugate) 可识别 Cas9(金黄色葡萄球菌)总蛋白的内源水平。该抗体不会与 Cas9(酿脓链球菌)、AsCpf1(菌株 BV3L6)和 FnCpf1(菌株 U112)蛋白发生交叉反应。

物种反应性:

预期的所有物种

来源/纯化

使用对 Cas9(金黄色葡萄球菌)蛋白的氨基末端具有特异性的重组蛋白对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 是一种 RNA 引导的 DNA 核酸酶,并且是化脓性链球菌 CRISPR 抗病毒免疫系统的组成部分,该系统提供针对外部染色体遗传物质的适应性免疫 (1)。CRISPR 抗病毒作用机制涉及三个步骤:(i) 通过宿主细菌取得外来 DNA;(ii) CRISPR RNA (crRNA) 的合成和成熟,随后形成 RNA-Cas 核酸酶蛋白质复合体;和 (iii) 通过该复合体识别外来 DNA 以及由 Cas 核酸酶活性的剪切作用进行定向干扰 (2)。II 型 CRISPR/Cas 抗病毒免疫系统可提供强有力的基因组精确编辑工具,并且具有特异性调节基因和治疗性应用的潜力 (3)。在细胞中必须引入或表达 Cas9 蛋白和引导 RNA(包含 crRNA 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 之间的融合)。引导 RNA 5' 末端的一个 20 核苷酸序列,可以把 Cas9 引导至特定的 DNA 靶标位点。因此,可“编程” Cas9 以便在体外及在细胞和生物中切割多种 DNA 位点。CRISPR/Cas9 基因组编辑工具已经用于许多生物体中,包括小鼠和人类细胞 (4,5)。研究显示,CRISPR 可以用来在啮齿类和灵长类胚胎干细胞中产生突变等位基因或报告基因 (6-8)。

Cas9(金黄色葡萄球菌) 是一种较小但有效的 Cas9 同源基因,就像更常使用的 Cas9 同源基因 Cas9(酿脓链球菌)一样 (9)。

  1. Horvath, P. and Barrangou, R. (2010) Science 327, 167-70.
  2. Wiedenheft, B. et al. (2012) Nature 482, 331-8.
  3. Singh, P. et al. (2015) Genetics 199, 1-15.
  4. Cong, L. et al. (2013) Science 339, 819-23.
  5. Mali, P. et al. (2013) Science 339, 823-6.
  6. Li, D. et al. (2013) Nat Biotechnol 31, 681-3.
  7. Shen, B. et al. (2013) Cell Res 23, 720-3.
  8. Niu, Y. et al. (2014) Cell 156, 836-43.
  9. Ran, F.A. et al. (2015) Nature 520, 186-91.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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