Calreticulin (D3E6) XP^® Rabbit mAb (Alexa Fluor^® 594 Conjugate) #77344

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液和试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
3. 甲醇，100%
4. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100)：要配制 10 ml：添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH₂O 中，混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。
6. Prolong^® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong^® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸去固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 甲醇通透步骤：在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇（使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm，不要让其干燥），并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟，同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
3. 封闭时，按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
4. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
5. 4°C 温度下孵育过夜。
6. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
7. 使用 Prolong^® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong^® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
8. 为达到最佳效果，立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
2. 4% 甲醛，不含甲醇 (#47746)
3. 100% 甲醇 (#13604)：用前冷却
4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。

注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com，了解经流式细胞术验证的细胞染料完整列表。

B. 固定

注：固定前，应分离黏附细胞或组织，并放在单细胞悬浮液中。

注意：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，这类抗体保持结合目的靶标。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

1. 进行离心使细胞沉淀，并去除上清液。
2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物，并阻止个别细胞出现交联。
3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
   1. 或者，细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度，以通透细胞。
2. 在冰上通透至少 10 分钟。
3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。（通常，每次实验 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞。）
2. 通过离心分离，用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
4. 室温孵育 1 小时。避光保存。
5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上进行分析。