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62304
Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
抗体偶联物
单克隆抗体
R
重组

Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #62304

引用 (7)
筛选器:
  1. IF
  2. F
Immunofluorescence Image 1: Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
使用 Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)(绿色)和 β-Actin (13E5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) #8046(红色)对 NIH/3T3 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。
Flow Cytometry Image 1: Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)
以浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #2975(虚线)作为对照,使用 Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)(实线)对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析。
To Purchase # 62304S
目录# 规格 价格 库存
62304S
100 µl (50 次检测)

支持性数据

反应性 H M R
灵敏度 内源性
MW (kDa)
来源/同种型 兔 IgG

应用关键词:

  • WB- 蛋白质印迹法
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • C&R - CUT&RUN
  • C&T - CUT&Tag
  • DB - 点印迹
  • eCLIP - eCLIP
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术

物种交叉反应性关键词:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴
  • Vir- 病毒
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-犬
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • GP-豚鼠
  • Rab-Rabbit
  • All-预期所有物种

产品说明

这种 Cell Signaling Technology 抗体偶联于 Alexa Fluor® 488 荧光染料,并针对人细胞中直接流式细胞分析接受内部检测。该抗体显示的物种交叉反应性预计与非偶联的 Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb #12238 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
免疫荧光法(免疫细胞化学) 1:50 - 1:200
流式细胞术(固定/通透) 1:50

保存

保存在 PBS(pH 为 7.2)、低于 0.1 % 的叠氮化钠和 2 mg/ml BSA 中。4°C 保存。切勿分装抗体。避光。切勿冷冻。

实验步骤

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免疫荧光法(免疫细胞化学)

A. 溶液与试剂

注意:用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (9808) 要制备 1L 1X PBS:添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛:16%,无甲醇,Polysciences 公司生产。(cat# 18814),使用新鲜制剂,小瓶打开后在 4°C 避光保存,同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 甲醇,100%
  4. 封闭液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425) / 0.3% Triton™ X-100):要配制 10 ml:添加 0.5 ml normal goat serum 和 0.5 ml 20X PBS 到 9.0 ml dH2O 中,混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  5. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100):要制备 10 ml,添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后,添加 0.1 g BSA (9998),并混合。
  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071),Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意:细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体,随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。注意:甲醛有毒性,仅可在通风橱中使用
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸去固定液,用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作(C 部分)。

C. 免疫染色

注意:所有随后的孵育都应当在室温下完成,除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育,以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 甲醇通透步骤:在细胞上覆盖冰冷的 100% 甲醇(使用足够的甲醇完全覆盖至 3–5 mm,不要让其干燥),并在 –20°C 下用甲醇孵育 10 分钟,同时用 1X PBS 漂洗 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭时,按产品网页中列出的抗体稀释缓冲液中稀释来制备一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜
  6. 用 1X PBS 漂洗三次,每次 5 分钟。
  7. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 以及带 DAPI (#8961) 的 Prolong® Gold AntiFade Reagent 盖住切片。
  8. 为达到最佳效果,立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下,可长期保存。

发布​时间 2006 年 11 月

修订时间 2010 年 12 月

实验步骤编号:220

流式细胞术,针对直接偶联抗体的甲醇透化实验步骤

A. 溶液与试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买,或使用下文所列的货号单独购买。

:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS):若要制备 1 L 1X PBS:将 100 ml 10X PBS (#12528) 添加到 900 ml 水,混合。
  2. 4% 甲醛,无甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604):用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液:购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616),或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来配制 0.5 % BSA PBS 缓冲液。4°C 保存。

:在您的实验中加入荧光细胞染料(包括活力指示染料、DNA 染料等)时,请参考染料产品网页,了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com,了解经验证用于流式细胞术的细胞染料完整列表。

B. 固定

:固定前,贴壁细胞或组织应予以解离并处于单细胞悬液中。

:最佳离心条件会根据细胞类型和试剂容量变动。一般,1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀下来。

:如果使用全血,则在固定前裂解红细胞并通过离心来洗涤。

:如果表位被甲醛和/或甲醇破坏,可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白质的抗体。在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意,某些荧光团(包括 PE 和 APC)会被甲醇损坏,因此不应在透化前添加。如果您不确定,请进行小规模实验。

  1. 通过离心使细胞沉淀下来,移除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛重悬细胞。混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
  3. 室温 (20-25°C) 固定 15 分钟。
  4. 通过离心用过量 1X PBS 洗涤。将上清液弃于合适的废液缸中。以 0.5-1 ml 1 X PBS 重悬细胞。继续进行透化步骤。
    1. 或者,细胞可在 1X PBS 中 4°C 保存过夜。

C. 透化

  1. 通过温和涡旋混合的同时,向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇终浓度,使细胞透化。
  2. 在冰上透化最短 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色(D 部分)或将细胞 在 90% 甲醇中 -20°C 保存。

D. 免疫染色

:使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数目的细胞分装入试管或小孔中。(通常,每次测定 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。)
  2. 通过离心以过量 1X PBS 洗涤分离,以去除甲醇。将上清液弃于合适的废液缸中。如有必要,可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞,这种一抗按建议的稀释度或如通过滴定所确定那样以抗体稀释缓冲液配制。
  4. 室温孵育 1 小时。避光。
  5. 在抗体稀释缓冲液或 1X PBS 中通过离心洗涤。弃去上清液。重复。
  6. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞,并在流式细胞分析仪上分析。

发布​时间 2009 年 7 月

修订时间 2020 年 6 月

实验步骤编号:407

特异性/灵敏度

Calreticulin (D3E6) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate) 可检测总钙网蛋白的内源水平。当钙网蛋白出现在细胞表面时,在免疫原性细胞死亡等条件下,该抗体可用于检测活细胞上的钙网蛋白。

物种反应性:

人, 小鼠, 大鼠

来源/纯化

使用与人钙网蛋白氨基末端周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

钙是一种参与许多细胞功能的通用信号转导分子,如细胞运动、代谢、蛋白质修饰、蛋白质折叠和细胞凋亡。钙存储在内质网 (ER) 中,在内质网内通过钙离子结合分子伴侣(如钙联蛋白和钙网蛋白)缓冲,并通过 IP 3 受体通道释放 (1)。钙网蛋白也作为内质网的分子伴侣起作用,以确保新合成糖蛋白的正确折叠和质量控制。因此,推测钙网蛋白不会改变蛋白质的折叠,而是在恰当的时间点调节有效折叠和亚基组装。此外,在内质网中,钙网蛋白以非天然构象保存蛋白质,并对其进行靶向降解 (2,3)。
  1. Groenendyk, J. et al. (2004) Mol Cells 17, 383-9.
  2. Nauseef, W.M. et al. (1995) J Biol Chem 270, 4741-7.
  3. Williams, D.B. (2006) J Cell Sci 119, 615-23.

限制使用

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。
Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。
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