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15798
Brd2 (D89B4) Rabbit mAb (Biotinylated)
偶联抗体
单克隆抗体

Brd2 (D89B4) Rabbit mAb (Biotinylated) #15798

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筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1 - Brd2 (D89B4) Rabbit mAb (Biotinylated)

使用 Brd2 (D89B4) Rabbit mAb (Biotinylated) 对 HeLa 和 MDA-MB-231 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。

购买 # 15798S
产品货号 规格 价格 库存
15798S
100 µl

支持数据

反应性 H M
敏感性 内源性
MW (kDa) 110
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体在最合适的条件下偶联生物素。该生物素化抗体显示的物种交叉反应性预计与非偶联的 Brd2 (D89B4) Rabbit mAb #5848 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 136 mM NaCl、2.6 mM KCI、12 mM 磷酸氢二钠(pH 为 7.4)、2 mg/ml BSA 和 50 % 甘油中。存储温度为 -20℃。不要分装抗体。‭

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育,轻晃孵育一整夜。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制备 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  14. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. Streptavidin-HRP:(#3999)。
  16. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Streptavidin-HRP (#3999 以适宜的稀释度)在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:266

特异性/敏感性

Brd2 (D89B4) Rabbit mAb (Biotinylated) 可检测 Brd2 总蛋白的内源水平。

物种反应性:

人, 小鼠

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种:

大鼠, 猴

来源/纯化

使用与人 Brd2 蛋白 Ala310 周围的残基对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

Brd2 是溴结构域蛋白 BET 亚家族的高度保守成员,该亚家族包含两个串联氨基末端溴结构域和一个羧基末端额外末端 (ET) 结构域 (1)。除了通过结合多个 E2F 参与引导细胞周期基因的表达 (2),Brd2 还表明与多种转录调节因子有关,包括 TFIID 和 Swi/Snf 复合体 (3,4)。Brd2 首先被鉴定为细胞核丝氨酸/苏氨酸激酶 (5)。像其他溴结构域蛋白一样,Brd2 通过调节染色质结构和转录在哺乳动物发育过程中发挥作用 (6)。Brd2 已表明通过乙酰化 Lys12 结合组蛋白 H4,组蛋白 H4 是多种组蛋白乙酰转移酶转录共激活因子的底物 (7)。在小鼠中,Brd2 在胚胎形成期间以及在成年睾丸、卵巢和大脑中均具有最高的表达水平 (8,9,10)。由于神经管关闭缺陷,缺乏 Brd2 的小鼠胚胎会显示发育延迟和最终死亡 (11)。Brd2 基因启动子的突变与少年型肌阵挛性癫痫 (JME) 易感性增加有关 (12)。

  1. Florence, B. and Faller, D.V. (2001) Front Biosci 6, D1008-18.
  2. Denis, G.V. et al. (2000) Cell Growth Differ 11, 417-24.
  3. Crowley, T.E. et al. (2002) Mol Endocrinol 16, 1727-37.
  4. Denis, G.V. et al. (2006) J Proteome Res 5, 502-11.
  5. Denis, G.V. et al. (2000) Cell Growth Differ 11, 417-24.
  6. Gyuris, A. et al. (2009) Biochim Biophys Acta 1789, 413-21.
  7. Kanno, T. et al. (2004) Mol Cell 13, 33-43.
  8. Shang, E. et al. (2004) Gene Expr Patterns 4, 513-9.
  9. Trousdale, R.K. and Wolgemuth, D.J. (2004) Mol Reprod Dev 68, 261-8.
  10. Crowley, T.E. et al. (2002) Mol Endocrinol 16, 1727-37.
  11. Gyuris, A. et al. (2009) Biochim Biophys Acta 1789, 413-21.
  12. Pal, D.K. et al. (2003) Am J Hum Genet 73, 261-70.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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