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8936
ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)
偶联抗体
单克隆抗体

ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb (Biotinylated) #8936

引用 (2)
筛选器:
  1. WB
Western Blotting Image 1: ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)

使用 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb (Biotinylated) 对 NCI-H2228 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。Streptavidin-HRP #3999 用于检测。

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支持数据

反应性 H
敏感性 内源性
MW (kDa) 220 (ALK)、80 (NPM-ALK)、117 (EML4-ALK v1)、86 (EML4-ALK v3)
来源/亚型 兔 IgG

应用缩写:

  • W-Western
  • IP-免疫沉淀法
  • IHC-免疫组织化学法
  • ChIP-染色质免疫沉淀法
  • IF-免疫荧光法
  • F-流式细胞术
  • E-P-ELISA 肽

物种交叉反应性缩写:

  • H-人
  • M-小鼠
  • R-大鼠
  • Hm- 仓鼠
  • Mk-猴子
  • Mi-水貂
  • C-鸡
  • Dm-黑腹果蝇
  • X-爪蟾
  • Z-斑马鱼
  • B-牛
  • DG-狗
  • PG-猪
  • Sc-酿酒酵母
  • Ce-秀丽隐杆线虫
  • Hr-马
  • All-预期所有物种

产品说明

Cell Signaling Technology 的这种抗体在最合适的条件下偶联生物素。该生物素化抗体的物种交叉反应性预计与非偶联的 ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb #3633 相同。

产品使用信息

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000

保存

保存在 136 mM NaCl、2.6 mM KCI、12 mM 磷酸氢二钠(pH 为 7.4)、2 mg/ml BSA 和 50 % 甘油中。存储温度为 -20℃。切勿分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween® 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育,同时轻轻晃动。

注意:请参阅一抗产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

注意:使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS):(#9808) 要制备 1 L 1X PBS:加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS):(#12498) 要制备 1 L 1X TBS:加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液:Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液,以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液:(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液:添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液:(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液:将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中,并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液:(#9997) 要制备 1 L 1X TBST: 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉:(#9999)。
  8. 封闭缓冲液:含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 150 ml,将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液:(#9997) 1X TBST。
  10. 一抗稀释缓冲液:含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST;要制备 20 ml,将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  11. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack:(#7727)。
  12. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa):(#13953)。
  13. 印迹膜:(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  14. Streptavidin-HRP:(#3999)。
  15. 检测试剂:SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 取 20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。
  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意:建议将预染蛋白分子量标准品(#13953,10 µl/泳道)上样,以验证转膜的效率,生物素化蛋白质标准品(#7727,10 µl/泳道)可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意:体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移之后,在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中,在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗(按照产品网页中建议的适当稀释度)置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Streptavidin-HRP (#3999 以适宜的稀释度)在室温下于 10 ml 封闭缓冲液中孵育 1 小时并不时轻轻晃动。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测(D 部分)。

请勿加入用于检测生物素化蛋白标准品的 Anti-biotin, HRP-linked Antibody。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标准品可视化。

D. 蛋白质检测

使用说明:

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B(例如:要制备 10 ml,则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B),来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟,倒掉多余溶液(膜将保持湿润),然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2020 年 6 月

实验步骤编号:265

特异性/敏感性

ALK (D5F3®) XP® Rabbit mAb (Biotinylated) 可检测内源水平的 ALK 总蛋白以及 ALK 融合蛋白(如 EML4-ALK 变体和 NPM-ALK),即使在水平较低的情况下也可检测。该抗体不与其他家族成员发生交叉反应。

物种反应性:

来源/纯化

使用与人 ALK 蛋白中羧基末端残基相对应的重组蛋白,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 是多效生长因子 (PTN) 的一种酪氨酸激酶受体,PTN 是与胚胎脑发育有关的生长因子 (1-3)。在表达 ALK 的细胞中,PTN 诱导 ALK 和下游效因子 IRS-1、Shc、PLCγ 和 PI3 激酶发生磷酸化 (1)。ALK 最初被发现是转位产生的一种核磷蛋白 (NPM)-ALK 融合蛋白 (4)。研究人员发现,NPM-ALK 融合蛋白是一种与间变性淋巴瘤相关的结构激活且会致癌的酪氨酸激酶 (4)。研究文献表明,NPM-ALK 激活 PLCγ 可能是有丝分裂活性的关键步骤,可能与间变性淋巴瘤的发病机理有关 (5)。

针对非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系的研究文献,描述了与 ALK 和棘皮动物微管相关蛋白样 4 (EML4) 的不同的 ALK 致癌融合蛋白,并且在某些肺腺癌病例中存在相应融合转录蛋白。微管相关蛋白 EML4 的短氨基末端区域能融合到 ALK 的激酶结构域 (6-8)。

研究人员发现,ALK 与其他融合伴侣(如 TRK 融合基因 (TFG) 和 KIF5B)易位,这还与 NSCLC 相关 (6,7)。尤其是,在 3-7% 的 NSCLC 样本中发现 EML4-ALK 融合蛋白 (6-14)。

  1. Stoica, G.E. et al. (2001) J Biol Chem 276, 16772-9.
  2. Iwahara, T. et al. (1997) Oncogene 14, 439-49.
  3. Morris, S.W. et al. (1997) Oncogene 14, 2175-88.
  4. Morris, S.W. et al. (1994) Science 263, 1281-4.
  5. Bai, R.Y. et al. (1998) Mol Cell Biol 18, 6951-61.
  6. Rikova, K. et al. (2007) Cell 131, 1190-203.
  7. Takeuchi, K. et al. (2008) Clin Cancer Res 14, 6618-24.
  8. Soda, M. et al. (2007) Nature 448, 561-6.
  9. Takeuchi, K. et al. (2009) Clin Cancer Res 15, 3143-9.
  10. Palmer, R.H. et al. (2009) Biochem J 420, 345-61.
  11. Horn, L. and Pao, W. (2009) J Clin Oncol 27, 4232-5.
  12. Rodig, S.J. et al. (2009) Clin Cancer Res 15, 5216-23.
  13. Mino-Kenudson, M. et al. (2010) Clin Cancer Res 16, 1561-71.
  14. Kwak, E.L. et al. (2010) N Engl J Med 363, 1693-703.

通路和蛋白

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