蛋白质印迹实验步骤（针对 Conformation and Light-Chain Specific and Anti-Biotin Secondary Antibodies）

对于蛋白质印迹实验，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA 或 nonfat dry milk、1X TBS 和0.1% Tween-20 孵育，轻轻搅动，过夜。

注：请参阅一抗数据表，以了解建议的一抗稀释缓冲液和建议的抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (#9808) 要制备 1L 的 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml 水中，混匀。
2. 1X SDS 样品缓冲液： （#7722、#7723）：62.5 mM Tris-HCl（在 25°C 下 pH 为 6.8）、2% w/v SDS、10% 甘油、50 mM DTT、0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
3. 转移缓冲液： 25 mM Tris 碱、0.2 M 甘油、20% 甲醇 (pH 8.5)。
4. 10X Tris Buffered Saline (TBS)： ( #9997) 要制备 1 L 的 10X TBS：24.2 g Tris 碱、80 g NaCl；用 HCl（使用 1X）将 pH 调节至 7.6。
5. 脱脂乳粉： (#9999)（重量/体积 [w/v]）。
6. 封闭缓冲液：1X TBS、含有 5% w/v脱脂乳粉的 0.1% Tween-20；要制备 150 ml，添加 15 ml 10X TBS 到 135 ml 水中，混匀。添加 7.5 g 脱脂乳粉，混匀。搅拌时，添加 0.15 ml Tween-20 (100%)。
7. 洗涤缓冲液：1X TBS、0.1% Tween-20 (TBS/T)。
8. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
9. 一抗稀释缓冲液： 1X TBS、含有 5% BSA 或 5%脱脂乳粉的 0.1% Tween-20（如一抗数据表所示）；要制备 20 ml，添加 2 ml 10X TBS 到 18 ml 水中，混匀。添加 1.0 g BSA 或脱脂乳粉，混匀。搅拌时，添加 20 μl Tween-20 (100%)。
10. Phototope^®-HRP 蛋白质印迹检测系统： (anti-rabbit #7071) (anti-mouse #7072) 包括生物素化的蛋白梯 (#7727)、辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗 (anti-rabbit #7074) (anti-mouse #7076)、anti-biotin HRP-linked antibody (#7075)、LumiGLO 化学发光试剂和过氧化物 (#7003)。
11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format)： (#7720)。
12. 印迹膜： 本实验步骤已针对 CST 建议的硝酸纤维素膜进行了优化。此外，也使用 PVDF 膜。

B. 蛋白质印迹

下面描述了样品制备的常规流程。

1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
4. 超声处理 10-15 秒后完成全细胞裂解，并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
5. 将 20 μl 样品加热至 95-100°C，时长 5 分钟；放在冰上冷却。
6. 用微量离心机分离 5 分钟。
7. 上样 20 μl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。注：CST 建议上样预染色的分子量标记物（#7720，10 µl/泳道），以验证电转移和生物素化蛋白梯（#7727，10 µl/泳道），从而测定分子量。
8. 电转移至硝酸纤维素或 PVDF 膜。

C. 膜封闭和抗体孵育

注：容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整容量。

I. 膜封闭

1. （可选）转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。
2. 膜在室温下用 25 ml 封闭液孵育 1 小时。
3. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

1. 在 4°C 下，将膜和一抗（按照产品数据表中建议的适当稀释度）放在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，轻轻搅动，过夜。
2. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。
3. 在 10ml 封闭缓冲液中，使用 Mouse anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (1:2000) 或 Anti-Biotin (D5A7) Rabbit mAb (#5597) 进行膜孵育，并在室温下轻轻搅动 1 小时。
4. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。

5. 对于 Mouse anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677 和
   Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678：

   将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (#7076) (1:2000) 和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075) (1:1000) 放在 10 ml 封闭液中室温孵育 1 小时，轻轻搅动，以检测生物素化的蛋白标记物。

   对于 Anti-Biotin (D5A7) Rabbit mAb #5597：

   在 10 ml 封闭缓冲液中，使用 Anti-Rabbit IgG, HRP-linked antibody (#7074) (1:2000) 进行膜孵育，并在室温下轻轻搅动 1 小时。

6. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。
7. 继续执行 D 部分的检测步骤。

D. 蛋白质检测

1. 将膜与 10 ml LumiGLO（0.5 ml 20X LumiGLO、0.5 ml 20X Peroxide 和 9.0 ml Milli-Q 水）放在室温下孵育 1 分钟，并不时轻轻搅动。注：如果信号反应太快，则可进一步稀释 LumiGLO 底物。
2. 将膜上多余的显影液沥干（勿令其干燥），包裹在塑料膜中，然后用 X 射线胶片曝光。初步暴露 10 秒应视为适当的暴露时间。注：由于检测反应的动力学，信号在 LumiGLO 孵育后立即变得最强，并在 2 小时后减弱。