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蛋白质印迹实验步骤(针对 Conformation and Light-Chain Specific and Anti-Biotin Secondary Antibodies)

对于蛋白质印迹实验,在 4°C 下,将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA 或 nonfat dry milk、1X TBS 和0.1% Tween-20 孵育,轻轻搅动,过夜。

:请参阅一抗数据表,以了解建议的一抗稀释缓冲液和建议的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS): (#9808) 要制备 1L 的 1X PBS,添加 50 ml 20X PBS 到 950 ml 水中,混匀。
  2. 1X SDS 样品缓冲液:#7722#7723):62.5 mM Tris-HCl(在 25°C 下 pH 为 6.8)、2% w/v SDS、10% 甘油、50 mM DTT、0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。
  3. 转移缓冲液: 25 mM Tris 碱、0.2 M 甘油、20% 甲醇 (pH 8.5)。
  4. 10X Tris Buffered Saline (TBS): ( #9997) 要制备 1 L 的 10X TBS:24.2 g Tris 碱、80 g NaCl;用 HCl(使用 1X)将 pH 调节至 7.6。
  5. 脱脂乳粉: (#9999)(重量/体积 [w/v])。
  6. 封闭缓冲液:1X TBS、含有 5% w/v脱脂乳粉的 0.1% Tween-20;要制备 150 ml,添加 15 ml 10X TBS 到 135 ml 水中,混匀。添加 7.5 g 脱脂乳粉,混匀。搅拌时,添加 0.15 ml Tween-20 (100%)。
  7. 洗涤缓冲液:1X TBS、0.1% Tween-20 (TBS/T)。
  8. 牛血清白蛋白 (BSA): (#9998)。
  9. 一抗稀释缓冲液: 1X TBS、含有 5% BSA 5%脱脂乳粉的 0.1% Tween-20(如一抗数据表所示);要制备 20 ml,添加 2 ml 10X TBS 到 18 ml 水中,混匀。添加 1.0 g BSA 脱脂乳粉,混匀。搅拌时,添加 20 μl Tween-20 (100%)。
  10. Phototope®-HRP 蛋白质印迹检测系统: (anti-rabbit #7071) (anti-mouse #7072) 包括生物素化的蛋白梯 (#7727)、辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗 (anti-rabbit #7074) (anti-mouse #7076)、anti-biotin HRP-linked antibody (#7075)、LumiGLO® 化学发光试剂和过氧化物 (#7003)。
  11. Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format): (#7720)。
  12. 印迹膜: 本实验步骤已针对 CST 建议的硝酸纤维素膜进行了优化。此外,也使用 PVDF 膜。

B. 蛋白质印迹

下面描述了样品制备的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基,使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基;用 1X PBS 洗涤细胞;吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10-15 秒后完成全细胞裂解,并剪切 DNA(以降低样品粘度)。
  5. 将 20 μl 样品加热至 95-100°C,时长 5 分钟;放在冰上冷却。
  6. 用微量离心机分离 5 分钟。
  7. 上样 20 μl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。:CST 建议上样预染色的分子量标记物(#7720,10 µl/泳道),以验证电转移和生物素化蛋白梯(#7727,10 µl/泳道),从而测定分子量。
  8. 电转移至硝酸纤维素或 PVDF 膜。

C. 膜封闭和抗体孵育

:容量适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜;对于不同尺寸的膜,请相应调整容量。

I. 膜封闭

  1. (可选)转移后,在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。
  2. 膜在室温下用 25 ml 封闭液孵育 1 小时。
  3. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 在 4°C 下,将膜和一抗(按照产品数据表中建议的适当稀释度)放在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育,轻轻搅动,过夜
  2. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  3. 在 10ml 封闭缓冲液中,使用 Mouse anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb (#3677) 或 Mouse anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (1:2000) 或 Anti-Biotin (D5A7) Rabbit mAb (#5597) 进行膜孵育,并在室温下轻轻搅动 1 小时。
  4. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  5. 对于 Mouse anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb #3677 和
    Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #3678:
    将膜与 Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (#7076) (1:2000) 和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody (#7075) (1:1000) 放在 10 ml 封闭液中室温孵育 1 小时,轻轻搅动,以检测生物素化的蛋白标记物。
    对于 Anti-Biotin (D5A7) Rabbit mAb #5597:
    在 10 ml 封闭缓冲液中,使用 Anti-Rabbit IgG, HRP-linked antibody (#7074) (1:2000) 进行膜孵育,并在室温下轻轻搅动 1 小时。
  6. 用 15 ml TBS/T 洗涤三次,每次 5 分钟。
  7. 继续执行 D 部分的检测步骤。

D. 蛋白质检测

  1. 使用 10 ml LumiGLO®(0.5 ml 20X LumiGLO®、0.5 ml 20X Peroxide 和 9.0 ml Milli-Q 水)进行膜孵育,并在室温下轻轻搅动 1 小时。:如果信号反应太快,则可进一步稀释 LumiGLO® 底物。
  2. 将膜上多余的显影液沥干(勿令其干燥),包裹在塑料膜中,然后用 X 射线胶片曝光。初步暴露 10 秒应视为适当的暴露时间。:由于检测反应的动力学,信号在 LumiGLO® 孵育后立即变得最强,并在 2 小时后减弱。

发布​于 2009 年 6 月 

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