胞核通透染色

针对： PCNA (PC10) Mouse mAb #2586

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)： 将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶解在 800 ml dH₂O 中。用 HCl 调节 pH 至 7.4 并调节体积至 1 L。室温储存。
2. 无水甲醇
3. 孵育缓冲液： 将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解在 100 ml 1X PBS 中。4°C 保存。
4. 通透缓冲液： 添加 0.5% Triton X-100、0.2 µg/ml EDTA 和 1% BSA 到 PBS 中。

A. 细胞分离和固定

1. 通过离心收集细胞并吸除上清液。
2. 将细胞短暂重悬于 100 µl PBS 中。
3. 添加 500 µl 透化缓冲液。在冰上孵育 15 分钟。
4. 添加3 ml 冰冷的 100 % 甲醇并且间歇混合 10 分钟。
5. 接着进行染色或在 -20°C 储存细胞。

B. 免疫染色

注：对于单克隆抗体，使用同型匹配的对照组；对于多克隆抗体，使用物种匹配的 IgG。使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

1. 将 0.5-1 x 10⁶ 个细胞分装入每个试验管（以体积计）。
2. 添加 2-3 ml 孵育缓冲液至每根试管，随后通过离心分离润洗。重复。
3. ​在每个测试管中加入100 μl 孵育缓冲液重悬细胞。
4. 在室温下封闭在孵育缓冲液中 10 分钟。
5. 添加适宜稀释度的未接合、生物素酰化的或荧光物质接合的一抗至试管（适宜稀释度参见各抗体数据表）。
6. 在室温下孵育一小时。
7. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
8. 如果使用荧光物质偶联的一抗，则在 0.5 ml PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上进行分析；对于非偶联或生物素化一抗，继续进行步骤 D9。
9. 在按建议稀释度用孵育缓冲液稀释的荧光物质偶联的二抗*或荧光物质偶联的亲和素中，重悬细胞。
10. 在室温孵育 30 分钟。
11. 按照前述说明，通过离心分离在孵育缓冲液冲洗。
12. 将细胞重悬于 0.5 ml PBS 中并且在流式细胞仪上分析；或者，对于 DNA 染色，转至步骤 C1。

C. 可选 DNA 染色

1. 在 0.5 ml 的 DNA 染料（例如 Propidium Iodide (PI)/RNase Staining Solution #4087）中重悬细胞。
2. 在室温孵育至少 5 分钟。

用流式细胞分析仪分析 DNA 染色的细胞。

*推荐的二抗：

兔抗

• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4412
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4413
• Anti-Rabbit IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4414

鼠抗

• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 488 Conjugate)#4408
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 555 Conjugate)#4409
• Anti-Mouse IgG (H+L)，F(ab')₂ Fragment (Alexa Fluor^® 647 Conjugate)#4410

抗大鼠

• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 488 Conjugate) #4416
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 555 Conjugate) #4417
• Anti-Rat IgG (H+L), (Alexa Fluor^® 647 Conjugate) #4418