KinomeView^® 实验步骤

针对： KinomeView® Profiling Kit #9812

注：化学发光和 X 射线胶片检测系统已对 KinomeView® 试剂盒中所含的所有基序抗体进行了验证。但如果需要高分辨率显影，则我们建议的显影平台为 LI-COR Odyssey 系统。

A. SDS-PAGE：

通常预制 4-20% 凝胶用于蛋白质印迹分析。

注：预制凝胶应是新鲜的（自生产日期起短于 4 周）。根据我们的经验，使用超过 8 周的预制 PAGE 凝胶会使结果质量变坏。

B. 溶液和试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

Cell Lysis Buffer (10X) #9803。
SDS 样品缓冲液 (3X)、Blue Loading Buffer Pack #7722、Red Loading Buffer Pack #7723。
转移缓冲液： 25 mM Tris 碱、0.2 M 甘油、20% 甲醇 (pH 8.5)。
10X Tris Buffered Saline (TBS)： 要制备 1L 10X TBS：24.2 g Tris 碱、80 g NaCl；用 HCl（使用 1X）将 pH 调节至 7.6。
10X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST-10X) #9997。
Nonfat Dry Milk #9999。
封闭缓冲液（X 射线胶片）： 1X TBS、0.1% Tween-20 (TBST) 和 5% w/v nonfat dry milk。
封闭缓冲液 (LI-COR)： 1X TBS 和 5% w/v nonfat dry milk。
洗涤缓冲液：1X TBS、0.1% Tween-20 (TBST)。
Bovine Serum Albumin (BSA) #9998。
一抗稀释缓冲液： 1X TBS、0.1% Tween-20 (TBST) 和 5% BSA。
化学发光检测（包括二抗）： Phototope^®-HRP Western Blot Detection System、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7071、Phototope^®-HRP Western Blot Detection System、Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7072。包括 Biotinylated Protein Ladder Detection Pack #7727、Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074、Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076、Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075、20X LumiGLO Reagent and 20X Peroxide #7003。
DyLight 偶联的二抗： Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5470、Anti-mouse IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5257、Anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight 680 Conjugate) #5366、Anti-rabbit IgG (H+L) (DyLight 800 Conjugate) #5151。
Prestained Protein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720。
印迹膜： 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。

C. 样品制备和进行 SDS-PAGE

用 1X Cell Lysis Buffer (10X) #9803 裂解细胞培养物或组织样品，对裂解物进行声处理和离心分离，以使不可溶的细胞碎片沉淀。
检查裂解物的蛋白浓度。用 SDS-PAGE 上样缓冲液将裂解物蛋白浓度调节至 1-2 µg/µl，以制备上样母液。
给 SDS-PAGE 中每个泳道上样 20 – 30 µg 蛋白裂解物 (10 – 20 µl)。如果使用 X 射线胶片，则还在其中一个泳道上样 5 µl 预染色的分子量标记物和生物素化分子量标记物混合物。如果使用 LI-COR Odyssey 系统，则还在其中一个泳道中上样 5 µl 预染色的标记物。以 130 伏特对凝胶进行处理，直至染料到达凝胶底部。
注：生物素化分子量标记物可使用抗生物素抗体检测；预染色的标记物在 LI-COR Odyssey 系统中自发荧光。
电转移至硝酸纤维素膜。

D. 膜封闭和抗体孵育

I. 膜封闭

膜用实验步骤专用封闭缓冲液室温孵育 1 小时，轻轻搅动。
用 TBS/T 稍微漂洗。

II. 一抗孵育

在 4°C 下，将膜与一抗 (1:1000) 放入一抗稀释缓冲液中孵育过夜，轻轻搅动。
用 TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。

III. 二抗孵育：

X 射线胶片：

将膜与相应物种 HRP 偶联二抗 (1:2000) 和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody #7075 (1:1000) 放入封闭缓冲液中室温孵育 1 小时，轻轻搅动，以检测生物素化蛋白标记物。
用 TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。
继续执行 E 部分的检测步骤。

LI-COR Odyssey 系统：

将膜与相应物种染料偶联的二抗 (1:10,000) 放入 LI-COR 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时，并不时轻轻搅动。
用 TBS/T 洗涤三次，每次 5 分钟。
在室温下让膜干燥。膜干燥后，随后可直接扫描，或存放在室温下，供后续扫描。

E. 蛋白检测