免疫组织化学实验步骤（石蜡）

*重要提示： 请参阅产品数据表，了解相应抗体稀释剂和抗原修复流程。IHC 实验步骤： 修复缓冲液/抗体稀释剂。

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）
3. 去离子水 (dH₂O)
4. Hematoxylin（可选）
5. 洗涤缓冲液：
   1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)： 要制备 1 L，添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH₂O 中。添加 1 ml Tween-20，混匀。
   10X Tris Buffered Saline (TBS)： 要制备 1 L，添加 24.2 g Trizma 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH₂O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
6. *抗体稀释剂：
   1. SignalStain^® Antibody Diluent #8112
   2. TBST/5% normal goat serum (#5425)： 往 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl normal goat serum。
   3. PBST/5% normal goat serum (#5425)： 往 5 ml 1X PBST 中添加 250 µl normal goat serum。
      1X PBS/0.1% Tween-20 (1X PBST)： 要制备 1 L，添加 100 ml 10X PBS 到 900 ml dH₂O 中。添加 1 ml Tween-20，混匀。
      10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要制备 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4​g 磷酸一钾 (KH₂PO₄) 到 1 L dH₂O 中。调节 pH 至 7.4。
7. *抗原修复：
   1. 柠檬酸： 10 mM 柠檬酸钠缓冲液：要制备 1 L，添加 2.94 g 柠檬酸钠三钠盐二水化物 (C₆H₅Na₃O₇•2H₂O) 到 1 L dH₂O 中。调节 pH 至 6.0。
   2. EDTA： 1 mM EDTA：要制备 1 L，添加 0.372 g EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 到 1 L dH₂O 中。调节 pH 至 8.0。
   3. TE： 10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 值 9.0：要制备 1L，添加 1.21 g Trizma 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 0.372 g EDTA (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂•2H₂O) 到 950 ml dH₂O 中。调整 pH 值至 9.0，然后用 dH₂O 将最终溶液定容至1000 ml。
   4. 胃蛋白酶： 在 Tris-HCl 中为 1 mg/ml，pH 2.0。
8. 3% 过氧化氢： 要制备，添加 10 ml 30% H₂O₂ 到 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液： TBST/5% normal goat serum (#5425)：往 5 ml 1X TBST 中添加 250 µl normal goat serum。
10. 生物素化二抗。
11. ABC 试剂： （Vectastain ABC Kit，加州伯林盖姆 Vector Laboratories, Inc.） 在使用前 30 分钟，按照制造商的说明制备。
12. DAB 试剂或合适底物： 按照制造商的建议制备。

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. *抗原修复

注：请参阅产品数据表，了解有关修复液的具体建议。

1. 对于柠檬酸： 将玻片放入 10 mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中煮沸，随后在亚沸温度下煮 10 分钟。在实验台上冷却玻片 30 分钟。
2. 对于 EDTA： 将玻片放入 1 mM EDTA (pH 8.0) 中煮沸，随后在亚沸温度下煮 15 分钟。无需冷却。
3. 对于 TE： 将玻片放入 10 mM TE/1 mM EDTA (pH 9.0) 中煮沸，随后在亚沸温度下煮 18 分钟。在实验台上冷却 30 分钟。
4. 对于胃蛋白酶： 在 37°C 下消化 10 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3% 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

注：请参阅产品数据表，了解建议的抗体稀释剂。

4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 每块切片用 100-400 µl 封闭液室温封闭 1 小时。
6. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的 100–400 µl 的一抗。4°C 温度下孵育过夜。
7. 清除抗体溶液，并用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 将每个切片中添加 100-400 µl 生物素化二抗（根据制造商建议在 TBST 中进行稀释）。在室温孵育 30 分钟。
9. 如果使用 ABC 亲和素/生物素方法，则根据制造商的说明制备 ABC 试剂，并在室温下孵育溶液 30 分钟。
10. 清除二抗溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 每块切片添加 100-400 µl ABC 试剂，并在室温下孵育 30 分钟。
12. 清除 ABC 试剂，切片用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次5分钟。
13. 向每块切片添加 100-400 µl DAB 或合适底物，并密切监测染色。
14. 一旦形成切片，便将玻片浸入 dH₂O 中。
15. 如有需要，按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
16. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
17. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
18. 封装盖玻片。