免疫组织化学实验步骤（冷冻）

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯
2. 乙醇（无水变性，组织级 100% 和 95%）。
3. Hematoxylin（可选）
4. 固定剂：如需了解最佳固定剂，请参阅产品数据表
   1. 10% 中性缓冲福尔马林
   2. 丙酮
   3. 甲醇
   4. 16% 甲醛
      1. 3% 甲醛： 要制备，添加 18.75ml 16% 的甲醛到 81.25 ml 的 1X PBS 中。
5. 10X Tris Buffered Saline (TBS)： 要制备 1 L，添加 24.2 g Trizma 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH₂O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。
6. 洗涤缓冲液： 1X Tris 盐缓冲液 (TBS)；要制备 1L，添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH₂O 中。
7. 甲醇/过氧化物酶： 制备方法：将 10 ml 30% H₂O₂ 加入到 90 ml 甲醇中。储存于 -20°C 的温度下。
8. 封闭液： 1X TBS/0.3% Triton-X 100/5% normal goat serum (#5425)。要制备： 添加 500µl 羊血清和 30 µl Triton-X 100 到 9.5 ml 1X TBS 中。
9. 生物素化二抗。
10. ABC 试剂： （Vectastain ABC Kit，加州伯林盖姆 Vector Laboratories, Inc.）。在使用前 30 分钟，按照制造商的说明制备。
11. DAB 试剂或合适底物： 按照制造商的建议制备。

B. 切片制作

1. 对于储存在 -80°C 下的组织：尝试制备切片前，从冰箱中取出来，并在 -20°C 下平衡约 15 分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。
2. 将组织切成厚度在 6–8 µm 之间的切片，并将其置于带正电荷的载玻片上。
3. 固定前，将切片放置在工作台上风干几分钟（这样有助于加强切片与载玻片之间的黏附）。

C. 固定

注：参考产品数据表，确定最佳固定剂。

1. 组织切片晾干后，按照以下步骤使用最佳的固定剂固定。
   1. 10% 中性缓冲福尔马林： 在室温下固定 10 分钟。立即进入染色步骤。
   2. 冷冻丙酮： 在 -20°C 下固定 10 分钟。风干。立即进入染色步骤。
   3. 甲醇： 在 -20°C 下固定 10 分钟。立即进入染色步骤。
   4. 3% 甲醛： 在室温下固定 15 分钟。立即进入染色步骤。
   5. 3% 甲醛/甲醇： 在 3% 甲醛中室温固定 15 分钟，之后在 -20°C 下用甲醇固定 5 分钟（中间不漂洗）。立即进入染色步骤。

D. 染色

1. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。
2. 在室温下，用在甲醇中稀释的 3% H₂O₂ 孵育 10 分钟。
3. 用洗涤缓冲液清洗切片两次，持续 5 分钟。
4. 在室温下，每块切片用封闭液封闭 1 小时。
5. 清除封闭液，并向每块切片加入 100–400 µl 稀释的一抗。（在封闭液中稀释抗体）。4°C 孵育过夜。*参阅产品数据表，确定建议的稀释度。
6. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
7. 向每块切片添加 100-400 µl 二抗，二抗根据制造商的建议在封闭液中稀释。在室温孵育 30 分钟。
8. 如果使用 ABC 亲和素/生物素方法，则根据制造商的说明制备 ABC 试剂，并在室温下孵育溶液 30 分钟。
9. 清除二抗溶液，切片用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。
10. 向每块切片添加 100-400 µl ABC 试剂，并在室温下孵育 30 分钟。
11. 清除 ABC 试剂，切片用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次5分钟。
12. 向每块切片添加 100-400 µl DAB 或合适底物，并密切监测染色。
13. 一旦形成切片，便将玻片浸入 dH₂O 中。
14. 如有需要，按照制造商的说明用 Hematoxylin 对切片进行复染色。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 封装盖玻片。