使用 Image-iT FX Signal Enhancer 的免疫荧光实验步骤

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

• 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：
  要制备 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄) 和 2.4​g 磷酸一钾 (KH₂PO₄) 到 1 L dH₂O 中。调节 pH 至 8.0。
• 甲醛（16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.，货号 18814），使用新鲜制剂，打开的小瓶避光保存在 4°C 下，用 PBS 稀释后使用。
• 通透缓冲液 (1X PBS/0.2% Triton X-100)：
  要制备 25 ml，添加 2.5 ml 10X PBS 和 22.5 ml dH₂O，混匀。搅拌时加入 50 µl Triton X-100。
• Image-iT FX Signal Enhancer (#11932)
• 封闭缓冲液 （1X PBS / 5% 常规山羊血清 (#5425) / 0.3% Triton X-100）：
  要制备 25 ml，添加 2.5 ml 10X PBS、1.25 ml normal goat serum 和 21.25 ml dH₂O，混匀。搅拌时加入 75 µl Triton X-100。
• 抗体稀释缓冲液 (1X PBS/1% BSA/0.3% Triton X-100)：
  要制备 40 ml 溶液，将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH₂O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌时加入 120 µl Triton X-100。
• Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应直接在多孔平板、腔室玻片或在盖玻片上生长、处理、固定和染色。

1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
   注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
2. 室温下固定细胞 15 分钟。
3. 吸干固定液，用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

1. 在通透缓冲液中室温通透处理细胞 5 分钟。
2. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
3. 滴 3-4 滴 Image-iT FX Signal Enhancer (#11932)，并在室温下孵育 30 分钟。
4. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
5. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
6. 封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
7. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
8. 4°C 温度下孵育过夜。
9. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
10. 使用 Prolong Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
11. 为达到最佳效果，应立即采用适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。