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使用 DOTMAC 通透方法的免疫荧光实验步骤

重要事项：请参考数据表首页的应用部分，以确定该产品是否已经验证并获批用于本实验步骤。

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  • 10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：为了配制 1 L，添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4​g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4​g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 8.0。
  • 甲醛（16%，不含甲醇，Polysciences, Inc.，货号 18814），使用新鲜制剂，打开的小瓶避光保存在 4°C 下，用 PBS 稀释后使用。
  • 十二烷基三甲基氯化铵 (DOTMAC)，>97.0%，TCI America（货号：D1016），用 PBS 重新配制再使用。
  • 封闭缓冲液 (1X PBS / 5% normal goat serum (#5425))：
    要制备 25 ml，添加 2.5 ml 10X PBS、1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（如常规山羊血清、常规驴血清） 和 21.25 ml dH2O，混匀。
  • 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA)：
    要制备 40 ml 溶液，将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH2O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。
  • 荧光物质偶联的二抗（建议使用的二抗）
    注：首次使用一抗或荧光素标记二抗时，将抗体滴定至最佳稀释比例，使样品在最少的背景干扰下，获得最强的特异性信号。
  • Prolong Gold AntiFade Reagent (#9071), with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 随后吸干液体，在细胞上覆盖一层 2–3mm 深的用 PBS 稀释的 4% 甲醛。
    注：甲醛有毒性，仅限在通风橱中使用。
  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另外注明需要在潮湿光密盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. DOTMAC 通透步骤：在细胞上覆盖用 PBS 稀释的 0.05% DOTMAC。在室温下孵育 15 分钟，用 PBS 漂洗三次，持续 5 分钟。
  2. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  3. 封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  4. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  5. 4°C 温度下孵育过夜。
  6. 用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
    注：如果使用直接偶联 Alexa Fluor® 荧光物质的一抗，则跳到步骤 C10。
  7. 在用抗体稀释缓冲液稀释的荧光素偶联的二抗中，室温孵育样品 1-2 小时，避光。
  8. 按照步骤 7，使用 PBS 漂洗。
  9. 使用 Prolong Gold Antifade Reagent (#9071), with DAPI (#8961) 对玻片封盖。
  10. 为达到最佳效果，立即以适当的激发波长检测标本。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

*推荐的二抗：

兔抗

鼠抗

抗大鼠

发布​时间 2010 年 6 月

修订时间 2010 年 12 月

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