BrdU 细胞增殖化学发光实验步骤

A. 试剂制备

1. 用纯净水稀释 20X Wash Buffer（每个 BrdU ELISA 试剂盒均包括）来配制 1X Wash Buffer。
2. 用 Detection Antibody Diluent（绿色）按 1:100 的比例稀释 BrdU Detection Antibody，以配制 1X 检测抗体溶液。
3. 用 HRP-linked Antibody Diluent（红色）按 1:100 的比例稀释 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody，以配制 1X HRP 标记二抗溶液。
4. 用细胞培养基按 1:100 的比例稀释 BrdU，以配制 10X BrdU 溶液。

B. BrdU 掺入

1. 将细胞放入 96 孔板上，并与相应的检测物质进行孵育。一般的种子细胞数目为 2500–100000 个细胞/孔，具体取决于细胞生长率。一般的孵育时间为 1-72 小时。
2. 添加配制的 10X BrdU 溶液到平板孔中，以获得 1X 的最终浓度。（示例：如需往培养板添加 100 µl 培养基，则每孔添加 10 µl 10X BrdU 溶液。）
3. 将细胞放入恒温器。一般的孵育时间为 1-24 小时。
4. 去除培养基。如需悬浮细胞，则以 300 g 的离心力离心分离平板 10 分钟，随后去除培养基。

C. BrdU 检测

1. 按 100 µl/孔添加 Fixing/Denaturing Solution，并将平板放在室温下 30 分钟。去除溶液。
2. 按 100 µl/孔添加配制的 1X 检测抗体溶液，并将平板放在室温下 1 小时。去除溶液，平板用 1X Wash Buffer 洗涤 3 次。
3. 按 100 µl/孔添加配制的 1X HRP 标记二抗溶液，并将平板放在室温下 30 分钟。去除溶液，平板用 1X Wash Buffer 洗涤 3 次。
4. 通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution and Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。
5. 每孔添加 100 ml 工作溶液。添加底物 1-10 分钟内，使用平板光度计测量在 425 nM 处的相对光单位 (RLU)。在 10 分钟内读数时，可实现最佳信号强度。