免疫组织化学实验步骤 - 针对产品：12692

针对： SignalStain^® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit #12692

A. 溶液与试剂

1. 二甲苯。
2. 乙醇，无水变性，组织学分级（100% 和 95%）。
3. 去离子水 (dH₂O)。
4. Hematoxylin（可选）。

5. 洗涤缓冲液。

   注：洗涤将需要其他 10X TBST。

   1. Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (TBST-10X) #9997：要制备洗涤缓冲液，添加 100 μl Tris Buffered Saline with Tween^® 20 (TBST-10X) #9997 到 900 ml dH₂O 中。或
   2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：要制备 1 L，添加 24.2 g Trizma^® 碱 (C₄H₁₁NO₃) 和 80 g 氯化钠 (NaCl) 到 1 L dH₂O 中。使用浓 HCl 调整 pH 至 7.6。1X TBS/0.1% Tween^® 20 (1X TBST)：要制备 1 L，添加 100 ml 10X TBS 到 900 ml dH₂O 中。添加 1 ml Tween^® 20 并混合。
6. 抗体稀释剂：SignalStain^® Antibody Diluent #8112
7. 抗原修复：10 mM 柠檬酸钠缓冲液：要制备 1 L，添加 2.94 g 柠檬酸钠三钠盐二水化物 (C₆H₅Na₃O₇•₂H₂O) 到 1 L dH₂O 中。调节 pH 至 6.0。
8. 3% 过氧化氢：要制备，添加 10 ml 30% H₂O₂ 到 90 ml dH₂O 中。
9. 封闭液：1X TBST/5% normal goat serum：添加 100 μl 10X TBST (#9997) 和 50 μl normal goat serum (#5425) 到 850 μl dH₂O 中。
10. 检测系统：SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) (#8114)。
11. 基质：SignalStain^® DAB Substrate Kit (#8059)，包括 SignalStain^® DAB Diluent (11724) 和 SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate (#11725)。
12. 苏木精：Hematoxylin(#14166)。
13. 封固剂：SignalStain^® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化合步骤：
   1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
   2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
   3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
2. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

1. 将玻片放入 10 mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中煮沸，随后在亚沸温度下煮 10 分钟。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

1. 用 dH₂O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
3. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
5. 每块切片用 100-200 μl 封闭液室温封闭 1 小时。
6. 清除封闭液，每块切片添加 100–200 μl 按 1:500 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 中稀释的一抗。4°C 孵育过夜。
   1. Rabbit (DA1E) mAb XP^® SignalStain^® Isotype Control (#12960) 被用作阴性对照。按 1:500 在 SignalStain^® Antibody Diluent (#8112) 稀释，并对每块切片用 100–200 μl。
7. 让 SignalStain^® Boost Detection Reagent (#8114) 平衡至室温。
8. 清除抗体溶液，在洗涤缓冲液中清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
9. 根据需要，在切片上滴 1-3 滴 SignalStain^® Boost Detection Reagent (#8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
11. 使用前，添加 30 μl SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate (11725) 到 1 ml SignalStain^® DAB Diluent (#11724) 中，混匀。
12. 每块切片用 100–400 μl SignalStain^® DAB，并密切观察。通常，1-10 分钟即可产生可接受的染色强度。
13. 将切片浸入 dH₂O 中。
14. 如有需要，按照制造商的说明用 hematoxylin 对切片进行复染色。
15. 用 dH₂O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
16. 脱水环节：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
17. 封装盖玻片。