用于检测转录因子的流式细胞术 (F) 实验步骤

A. 溶液与试剂

注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：( #9808) 为了制备 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH₂O，然后将其混匀。
2. 甲醛（无甲醇）。
3. 2% 甲醛（在 PBS 中稀释的甲醛原液；在实验当天新鲜制备）。
4. Triton X-100。
5. 孵育缓冲液：将 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 溶解在 100 ml 1X PBS 中。4°C 保存。

B. 固定

注：按照制造商的要求，应在固定/通透前对活细胞进行表面抗原免疫染色。

1. 在每个测试管中，将含有 1–2 x 10⁶ 个细胞的新鲜分离的细胞悬浮液调整至 100 μl 孵育缓冲液。
2. 按照制造商建议的容量或浓度添加表面抗原抗体到测试管中，随后放在冰上孵育 30 分钟。
3. 添加 2 ml 孵育缓冲液后，通过离心分离进行洗涤。
4. 抽吸上清液后，重悬在 500 μl 的 2% 甲醛中。
5. 在室温下固定 15 分钟。
6. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

C. 透化

1. 向细胞沉淀物添加 1ml 0.1% Triton X-100（在 PBS 中按体积分数计量）。
2. 重悬并在室温下静置 30 分钟。
3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。

D. 免疫染色

1. 在 100 μl 抗体工作液中重悬细胞团，稀释于孵育缓冲液中，稀释度按照抗体说明书或产品网页说明。
2. 室温孵育 1 小时。
3. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
4. 如果使用荧光染料标记的一抗，则在 350 μl 孵育缓冲液中重悬细胞，并使用流式细胞分析仪进行分析；对于未标记或生物素化的一抗，则继续执行步骤 5。
5. 在荧光染料标记的二抗中重悬细胞，并按照制造商建议的稀释度在孵育缓冲液中稀释。
6. 室温孵育 30 分钟。
7. 用孵育缓冲液离心洗涤 2 次。
8. 在 350 μl 孵育缓冲液中重悬细胞，并使用流式细胞术进行分析。