固定免疫沉淀实验步骤/（用于通过蛋白质免疫印迹实验进行分析）

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)
2. 1X 细胞裂解缓冲液： (#9803) 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM 焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸酯、1 mM Na₃VO₄、1 µg/ml 亮抑酶肽

注：CST 建议在使用前添加 1 mM PMSF*。

3. 3X SDS 样品缓冲液： (#7722) 187.5 mM Tris-HCl（pH 值6.8 ，25°C 条件），6% w/v SDS，30% 甘油，150 mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS，每块平板 (10cm) 添加 0.5ml 1X 冰冷的细胞裂解缓冲液和 1 mM PMSF*，平板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，并且可将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上对样品超声处理四次，每次 5 秒钟。
6. 在 4°C 下微量离心 10 分钟，然后将上清液转移到一根新的试管中。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

1. 取 200 μl 细胞裂解物，并添加 10 µl 固定抗体，在 4°C 下孵育过夜，轻轻摇动。
2. 4°C 条件下微量离心 30 秒。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
3. 使用 20 μl 3X SDS 样品缓冲液使沉淀物重新悬浮。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
4. 将样品加热到 95–100°C 并持续 2–5 分钟。
5. 将样品上样 (15–30 µl) 到 SDS-PAGE 凝胶 (12–15%) 上。
6. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）