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Multiplex Oligos for Illumina Protocol (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN)

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有非常适合在 Illumina 平台 (Illumina, Inc.) 上针对 NG-seq 制备复用样品的接头和引物。这种试剂盒可以用于生成可并入单个测序反应中多达12 个不同的条形码化 ChIP-seq 或 CUT&RUN DNA 文库。

每种试剂盒组分都必须符合严苛的质量控制标准，并且对于每个新批次，都通过在 Illumina 测序平台上构建索引化文库并对其测序来功能性验证整套试剂。

本产品提供足以制备多达 24 个 DNA 测序文库的试剂，并且必须与 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 联合使用。

兼容的上游检测试剂盒：

  • CUT&RUN Assay Kit #86652
  • SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
  • SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
  • SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #56383

不兼容的上游检测试剂盒：

注：琼脂糖珠被超声处理的鲑鱼精子 DNA 封闭，这将污染 DNA 库制备和 NG-seq。

  • SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
  • SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004

构建 DNA 库所需的其他产品：

  • DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795

所需的试剂：
包括的试剂：

  1. •（红色）Adaptor for Illumina #42436
  2. •（红色）USER Enzyme #59713
  3. •（蓝色）Universal PCR Primer for Illumina #12078
  4. •（蓝色）Index 1 Primer for Illumina #28248
  5. •（蓝色）Index 2 Primer for Illumina #41836
  6. •（蓝色）Index 3 Primer for Illumina #64036
  7. •（蓝色）Index 4 Primer for Illumina #83765
  8. •（蓝色）Index 5 Primer for Illumina #18392
  9. •（蓝色）Index 6 Primer for Illumina #27180
  10. •（蓝色）Index 7 Primer for Illumina #43985
  11. •（蓝色）Index 8 Primer for Illumina #68962
  12. •（蓝色）Index 9 Primer for Illumina #83219
  13. •（蓝色）Index 10 Primer for Illumina #90275
  14. •（蓝色）Index 11 Primer for Illumina #28019
  15. •（蓝色）Index 12 Primer for Illumina #39090

未包括的试剂：

  1. 适用于 ChIP 或 CUT&RUN Illumina NG-seq 文库制备的酶和缓冲液：在 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中提供
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 新鲜制备的 80% 乙醇
  5. 1X TE（10 mM Tris-HCl，pH 为 8.0，1 mM EDTA）
  6. 10 mM Tris-HCl（pH 为 8.0-8.5）
  7. Magnetic Separation Rack #7017/#14654
  8. Bioanalyzer 和 Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCR 试管和 PCR

Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) 实验步骤

I. 简单的合并指南：

Illumina NG-seq 平台使用红色激光/LED 对 A/C 测序，并使用绿色激光/LED 对 G/T 测序。对于每个周期，需要读取红色和绿色通道，以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。如果未保持色彩平衡，则该索引读数测序可能会无效。请检查每个要使用的索引的序列，以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例：

索引表

以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的有效索引组合：

可一起测序的有效索引组合

如果每个索引引物随 Universal PCR Primer for Illumina 仅使用一次，则 Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) 可生成 12 份不同的条形码化样品。每个索引引物的量足以用于生成两个库，但这两个库无法合并到一个测序泳道中。

对于 1-plex（无混池），任意建立索引的引物均可与通用 PCR 引物共同使用。

II. Index 1-12 Primers for Illumina：

每种 Index Primer for Illumina 按 10 µl 体积提供。

其中 -s- 表示硫代磷酸键。

III. 设置 PCR 反应

  1. 确保是否使用了有效的索引引物组合。请参见第一和第二部分，验证是否选择了正确的引物组合。
  2. 每根 PCR 试管仅添加一份索引引物 (•) (5 µl) 和 5 µl 通用 PCR 引物 (•)。更换试管之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。
  3. 记录添加到每根 PCR 试管的索引引物。
  4. 向含有引物的每根试管添加 25 µl Q5 PCR Master Mix (•)。
  5. 往相应试管添加 15 µl 接头蛋白连接的 ChIP DNA，直至最终容量为 50 µl。轻轻上下摇晃 5–10 次以混匀。更换样品之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。
  6. 记录添加到每根 PCR 试管的接头蛋白连接的 DNA 样品。
  7. 根据推荐的循环条件快速离心并执行 PCR（请参阅 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中用于 ChIP-DNA 起始样品或 CUT&RUN DNA 起始样品的相应实验步骤）。
 

附录：试剂盒组分的质量控制

SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina (Single Index Primers) #29580 中诸组分在下文所列的功能检测中逐一验证，且必须符合严苛的质量控制标准。此外，每套组分都通过在 Illumina 测序平台上构建索引化文库并对其测序来加以功能性验证。

I. Adaptor for Illumina (15 μM) (•)

5´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´

质量控制检测

  1. 16 小时孵育：在 50 μl 反应体积中加入这种接头蛋白和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 浓度的反应缓冲液和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 5 μl 这种接头蛋白和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入至少 10 μl 这种接头蛋白，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。
  4. 核糖核酸酶活性：将这种接头蛋白和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。

II. USER Enyzme (•)

保存在：50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 μg/ml BSA 和 50% 甘油

质量控制检测

  1. 非特异性 DNase 活性（16 小时）：在 50 μl 反应体积中加入 1 μg λ DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg λ HindIII DNA 和至少 25 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。
  2. 核酸外切酶活性（放射活性释放）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [3H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 4 小时，最终释放的放射活性小于 0.1% 的总放射活性。在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 单双链 [3H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 10 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 4 小时，最终放射活性小于 0.5% 的总放射活性。
  3. 核酸内切酶活性（带切口）：在 50 µl 反应体积中加入 1 µg 超螺旋 φX174 DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 UDG Reaction Buffer 孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳测定带切口形式的转化率低于 10%。
  4. 磷酸酶活性：如通过405 nm 处分光光度计分析确定，在 37°C 于含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（pH 9.8 的 1 M 二乙醇胺和 0.5 mM MgCl2）中孵育最低 10 μl 1X 浓度 USER 酶下4 小时未产生可检出的对硝基苯阴离子。

III. Universal PCR Primer for Illumina (10 μM) (•)

5´-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC*T-3´

质量控制检测

  1. 16 小时孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1 μl 这种引物和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1 μl 引物 和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也无可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 5 μl 引物和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1 μl 引物和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 磷酸酶活性：在含 2.5 mM 对硝基苯磷酸盐的蛋白磷酸酶检测缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中加入至少 10 μl 这种引物，在 37°C 下孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有可检测的对硝基苯阴离子。

IV. Index 1-12 Primers for Illumina (10 μM) (•)

质量控制检测

  1. 16 小时孵育：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Index [X] Primer for Illumina 和 1 μg HindIII 已消化 λ DNA 的 50 μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的非特异性核酸酶降解。如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 Index [X] Primer for Illumina 和 1 μg T3 DNA 的 50 μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 µl Index [X] Primer for Illumina 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋化 DNA 的50 μl 反应在 37°C 孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳导致向 RF II（带切口的分子）转化低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 μl Index [X] Primer for Illumina 和 40 ng RNA 转录物的 10 μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的 RNA 降解。
  4. 磷酸酶活性：如通过 405 nm 处分光光度计分析确定，在 37°C 于含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（pH 9.8 的 1 M 二乙醇胺和 0.5 mM MgCl2）中孵育 Index [X] Primer for Illumina 4 小时未产生可检出的对硝基苯阴离子。

发布​时间 2022 年 6 月

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