信号微弱或没有信号 |
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可能原因 |
建议 |
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样品保存不当；如果荧光团暴露于光线下的时间过长，可能会导致信号衰减。 |
在避光条件下进行孵育和样品储存。可将样品封装于 ProLong® Gold 抗淬灭试剂 #9071 等抗光褪色溶液中。封装后要立即对样品进行成像，以获取最佳结果。 |
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细胞/组织样品的储存时间过长 |
使用新鲜制备的载破片/板，以避免丧失抗原性。 |
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固定不充分 |
请查阅 CST 产品数据表以了解建议的实验步骤；处理后立即去除培养基并用固定剂快速/彻底清洗。对于磷酸化特异性抗体，使用浓度至少为 4% 的甲醛来抑制内源性磷酸酶。 |
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抗体稀释度不正确（抗体过度稀释） |
请查阅 CST 产品数据表或 cellsignal.com 以了解建议的抗体稀释度。 |
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未使用建议的孵育时间 |
按照经严格检测的实验步骤进行一抗孵育，才能获得一致、可靠的结果。经开发和验证的 CST 抗体在 4°C 下过夜孵育时可获得最佳结果。 |
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测试模型不恰当 |
在可能的情况下，应使用蛋白质印迹法或其它方式来确认蛋白表达。 |
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未正确诱导靶蛋白 |
应针对每种靶标确定最佳处理条件和对照。 |
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目的蛋白表达较低 |
修改检测方法；考虑放大信号，或与更亮的荧光团配对。 |
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通透方法错误 |
请查阅数据表以了解建议的实验步骤。 |
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二抗使用不正确 |
按建议浓度使用，并检查二抗是否与一抗的宿主相匹配。 |
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激发波长错误 |
确保照射和检测（激光/激发/发射滤光片）与一个或多个荧光团的激发波长相匹配。 |
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多重 IHC 中信号较弱 |
优化脱蜡、抗原修复和信号放大方法。 |
高背景 |
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可能原因 |
建议 |
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样品自发荧光 |
以未经染色的样品为对照，检测自发荧光程度。请查看数据表以了解正确的固定试剂。陈旧的固定剂可能会产生自发荧光；更换陈旧甲醛存货并制备新鲜的稀释物。使用在安瓿中新鲜稀释的 EM 级戊二醛。对于低丰度靶标，选择较长的波长通道。 |
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封闭不充分 |
使用与二抗同一物种来源的正常血清。考虑使用基于电荷的封闭剂，例如 Image-iT® FX 信号增强剂 #11932，具体视背景来源而定。 |
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抗体稀释度不正确（一抗或二抗浓度过高） |
请查阅 CST 产品数据表或 cellsignal.com 以了解建议的抗体稀释度。 |
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样品变干 |
在整个染色过程中始终保持样品处于液体中，这一点非常关键。 |
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清洗不充分 |
清洗以去除多余固定剂、多余二抗，以及游离结合、非特异性抗体相互作用。 |
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二抗交叉反应性 |
使用同型对照抗体，以确定你的二抗是否发生交叉反应。 |
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非特异性抗体结合 |
如可能，请与敲低 (siRNA) 或敲除细胞进行比较，或与已知表达靶抗原的水平较高或较低的细胞进行比较。 |