Cat. # | Size | Price | Inventory |
---|---|---|---|
8814T | 20 µl | ||
8814S | 100 µl |
REACTIVITY | H M R Mk |
SENSITIVITY | Endogenous |
MW (kDa) | 92 |
Source/Isotype | Rabbit IgG |
Product Information
Application | Dilution |
---|---|
Western Blotting | 1:1000 |
Immunoprecipitation | 1:100 |
Immunohistochemistry (Paraffin) | 1:400 - 1:1600 |
Immunofluorescence (Immunocytochemistry) | 1:800 - 1:3200 |
Flow Cytometry (Fixed/Permeabilized) | 1:800 - 1:1600 |
Chromatin IP | 1:100 |
Chromatin IP-seq | 1:100 |
CUT&RUN | 1:100 |
For western blots, incubate membrane with diluted primary antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween® 20 at 4°C with gentle shaking, overnight.
NOTE: Please refer to primary antibody product webpage for recommended antibody dilution.
From sample preparation to detection, the reagents you need for your Western Blot are now in one convenient kit: #12957 Western Blotting Application Solutions Kit
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
Load 20 µl onto SDS-PAGE gel (10 cm x 10 cm).
NOTE: Loading of prestained molecular weight markers (#59329, 10 µl/lane) to verify electrotransfer and biotinylated protein ladder (#7727, 10 µl/lane) to determine molecular weights are recommended.
NOTE: Volumes are for 10 cm x 10 cm (100 cm2) of membrane; for different sized membranes, adjust volumes accordingly.
* Avoid repeated exposure to skin.
posted June 2005
revised June 2020
Protocol Id: 10
This protocol is intended for immunoprecipitation of native proteins utilizing Protein A agarose beads for analysis by western immunoblot or kinase activity.
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
10X Cell Lysis Buffer: (#9803) To prepare 10 ml of 1X cell lysis buffer, add 1 ml cell lysis buffer to 9 ml dH2O, mix.
NOTE: Add 1 mM PMSF (#8553) immediately prior to use.
IMPORTANT: Appropriate isotype controls are highly recommended in order to show specific binding in your primary antibody immunoprecipitation. Use Normal Rabbit IgG #2729 for rabbit polyclonal primary antibodies, Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 for rabbit monoclonal primary antibodies, Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 for mouse monoclonal IgG1 primary antibodies, Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 for mouse monoclonal IgG2a primary antibodies, Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 for mouse monoclonal IgG2b primary antibodies, and Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 for mouse monoclonal IgG3 primary antibodies. Isotype controls should be concentration matched and run alongside the primary antibody samples.
Proceed to one of the following specific set of steps.
NOTE: When using primary antibodies produced in rabbit to detect proteins with a molecular weight in the range of 50 kDa, we recommend using Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) or Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (or HRP conjugate #5127) as a secondary antibody to minimize interference produced by denatured rabbit heavy chain. For proteins with a molecular weight in the range of 25 kDa, Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) (or HRP conjugate #5127) is recommended to minimize interference produced by denatured mouse light chain.
When using primary antibodies produced in mouse to detect proteins with a molecular weight in the range of 50 kDa, we recommend using Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) (#58802) as a secondary antibody to minimize interference produced by denatured mouse heavy chain.
posted December 2008
revised October 2021
Protocol Id: 409
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
NOTE: Do not allow slides to dry at any time during this procedure.
For Citrate: Heat slides in a microwave submersed in 1X citrate unmasking solution until boiling is initiated; follow with 10 min at a sub-boiling temperature (95°-98°C). Cool slides on bench top for 30 min.
RECOMMENDED DETECTION REAGENTS |
SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 | SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653 |
---|---|---|
COMPATIBLE CHROMOGEN |
SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 | SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713 |
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632 | SignalStain® Ultra Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit #12824 | |
SignalStain® Deep Black Peroxidase Substrate Kit #72986 | ||
SignalStain® Radiant Yellow Peroxidase Substrate Kit #69644 |
NOTE: Use of detection reagents other than those specified in this protocol may require further optimization of the primary antibody to account for the different sensitivities of the detection reagents.
posted February 2010
revised June 2020
Protocol Id: 283
Achieve higher quality immunofluorescent images using the efficient and cost-effective, pre-made reagents in our #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
Recommended Fluorochrome-conjugated Anti-Rabbit secondary antibodies:
NOTE: Cells should be grown, treated, fixed and stained directly in multi-well plates, chamber slides or on coverslips.
Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2–3 mm with 4% formaldehyde diluted in 1X PBS.
NOTE: Formaldehyde is toxic, use only in a fume hood.
NOTE: All subsequent incubations should be carried out at room temperature unless otherwise noted in a humid light-tight box or covered dish/plate to prevent drying and fluorochrome fading.
posted November 2006
revised November 2013
Protocol Id: 24
All reagents required for this protocol may be efficiently purchased together in our Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593, or individually using the catalog numbers listed below.
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
NOTE: When including fluorescent cellular dyes in your experiment (including viability dyes, DNA dyes, etc.), please refer to the dye product page for the recommended protocol. Visit www.cellsignal.com for a full listing of cellular dyes validated for use in flow cytometry.
NOTE: Adherent cells or tissue should be dissociated and in single-cell suspension prior to fixation.
NOTE: Optimal centrifugation conditions will vary depending upon cell type and reagent volume. Generally, 150-300g for 1-5 minutes will be sufficient to pellet the cells.
NOTE: If using whole blood, lyse red blood cells and wash by centrifugation prior to fixation.
NOTE: Antibodies targeting CD markers or other extracellular proteins may be added prior to fixation if the epitope is disrupted by formaldehyde and/or methanol. The antibodies will remain bound to the target of interest during the fixation and permeabilization process. However, note that some fluorophores (including PE and APC) are damaged by methanol and thus should not be added prior to permeabilization. Conduct a small-scale experiment if you are unsure.
NOTE: Count cells using a hemocytometer or alternative method.
posted July 2009
revised June 2020
实验步骤编号:404
特定产品: SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。
包括的试剂:
未包括的试剂:
! | 这就表示在实验流程中基于免疫沉淀制备物(IP 制备物)数量的容积改变是重要的一步。一份 IP 制备物是指 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 离体的组织。 |
!! | 这就表示,进行操作前稀释缓冲液是重要的一步。 |
安全停止 | 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
当收获组织时,去除样品上不需要的材料,如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织,或在干冰上冷冻并储存于 -80°C 以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果,每次进行免疫沉淀法测试时,使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同,并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息,请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析(第四部分)。如果需要,应处理额外五份染色质样品,以最优化染色质消化(附录 B)。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。
为达到最佳染色质免疫沉淀法结果,每次免疫沉淀法使用大约 4 X 106 细胞进行实验(至少需要 12 X 106 个细胞以包含阳性和阴性对照)。对于 Hela 细胞,一次免疫沉淀相当于 15 cm 培养皿所含细胞(在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%)的一半。要进行染色质消化和浓度分析,应当处理一份额外样品(第四部分)。因为每种细胞类型都不相同,我们推荐您在实验中准备一盘额外的细胞,通过使用血球仪或细胞计数器确定细胞的数量。
(!) 所有缓冲液体积应根据使用的 15 cm 组织培养皿(或 20 ml 悬浮细胞)数量按比例增加。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。
(!!) 重要提示:一旦溶解,将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。
注意:为了获得最佳的 ChIP 结果,适宜大小和合适浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。
为了获得最佳的 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质(如第四部分中所测定)。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前,通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是,如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质,则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。
注意:Cell Signaling Technology 抗体在每份处于 1 和 2 ug 之间 IP 样品会取得最佳效果。当存在多份不同浓度的样品时,最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。
(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。
引物长度: | 24 个核苷酸 |
最佳 Tm: | 60℃ |
最佳 GC: | 50% |
扩增子尺寸: | 150 至 200 bp(标准 PCR) |
80 至 160 bp(实时荧光定量 PCR) |
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
无核酸酶的 H2O | 12.5 μl |
10X PCR 缓冲液 | 2.0 μl |
4mM dNTP 混合物 | 1.0 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2.0 μl |
Taq DNA 聚合酶 | 0.5 μl |
a. | 初始变性 | 95℃ | 5 分钟 |
b. | 变性 | 95℃ | 30 秒 |
c. | 复性 | 62℃ | 30 秒 |
d. | 延伸 | 72℃ | 30 秒 |
e. | 重复步骤 b-d,共循环 34 次。 | ||
f. | 终末延伸 | 72℃ | 5 分钟 |
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
无核酸酶的 H2O | 6 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2 μl |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95℃ 3 分钟 |
b. | 变性 | 95℃ 15 秒 |
c. | 复性和延伸: | 60℃ 60 秒 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
使用实时 PCR 仪的自带软件,分析定量 PCR 结果。或者,可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式,手动计算 IP 效率。采用这种方法,从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。
输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品)
C[T] = CT = PCR 反应的阈周期
用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库,请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于 Illumina® 平台上测序,我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关索引引物 Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。
建议:
从组织样品收获交联的染色质时,组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织(类似于 4 x 106 个 Hela 细胞)制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围,该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型,使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是,与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比,用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织,原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果,我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质,因此,对于某些组织,每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。
组织/细胞 | 染色质总产率 | 预期 DNA 浓度 |
---|---|---|
脾 | 20-30 μg/25 mg 组织 | 200-300 μg/ml |
肝 | 10-15 μg/25 mg 组织 | 100-150 μg/ml |
肾 | 8-10 μg/25 mg 组织 | 80-100 μg/ml |
脑 | 2-5 μg/25 mg 组织 | 20-50 μg/ml |
心脏 | 2-5 μg/25 mg 组织 | 20-50 μg/ml |
Hela | 10-15 μg/4 x 106 个细胞 | 100-150 μg/ml |
将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。
问题 | 可能的原因 | 建议 |
---|---|---|
1. 消化的染色质浓度过低。 | 添加至染色质消化的细胞数不足,或者胞核在消化后未完全裂解。 | 如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml,则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg,然后继续实验。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量,和/或在声波处理前后在显微镜下观察胞核,以证实胞核完全裂解。 |
2. 染色质消化不足且片段过大(大于 900 bp)。 | 细胞可能已经过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。 向染色质消化中添加过多细胞或未添加足够的 Micrococcal Nuclease。 | 在甲醛浓度固定的情况下进行一段时间。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;有关染色质消化的优化,参见附录 B。 |
3. 染色质过度消化并且片段过小(只有 150 bp 单核小体的长度)。在 PCR 定量期间,将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能削弱信号,尤其对于长度大于 150 bp 的扩增子更是如此。 | 添加至染色质消化的细胞不足或 Micrococcal Nuclease 过多。 | 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;有关染色质消化的优化,参见附录 B。 |
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。 | 添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。 PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。 添加至 IP 反应的染色质不足或染色质过度消化。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 使用来自交联并消化后的染色质的纯化 DNA,优化实验引物组的 PCR 条件。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到小于 150 碱基对(请参见第八部分中的引物设计建议)。 为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。 |
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。 | 添加至 IP 反应的染色质或抗体不足,或者 IP 孵育时间过短。 蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。 | 确保向每次 IP 反应中添加 5-10 μg 染色质和 10 μl 抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加蛋白 G 微珠后需额外孵育 2 小时。 在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳,同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。 |
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。 | 添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者,添加至 IP 反应的抗体过多。 添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。 | 向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。 向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则,不能准确测量起始 DNA 数量的差异。 |
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。 | 添加至 PCR 反应的 DNA 不足。 添加至 IP 反应的抗体不足。 抗体不适用于 IP。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 通常,需向 IP 反应中添加 1 至 5 µg 的抗体;但是,实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。 增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。 |
发布时间 2011 年 12 月
修订时间 2022 年 4 月
实验步骤编号:82
特定产品: SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。
包括的试剂:
未包括的试剂:
当收获组织时,去除样品上不需要的材料,如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织,或在干冰上冷冻以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果,每次进行免疫沉淀法测试时,使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同,并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息,请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析(第四部分)。
为了获得最佳 ChIP 结果,对于每次将要进行免疫沉淀法测试,使用大约 4 X 106 个细胞。对于 Hela 细胞,这相当于 15 cm 培养皿所含细胞(在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90 %)的一半。要进行染色质消化和浓度分析,应当处理一份额外样品(第四部分)。在实验中额外使用一培养皿的细胞,以便使用血细胞计数器测量细胞数目。
一份免疫沉淀制备物(IP 制备物)是指 25 mg 离散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞。
配制 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O)。确保 DTT 晶体完全溶解。
重要提示:一旦溶解,将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。
注意:为了获得最佳的 ChIP 结果,适宜大小和合适浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。
为了获得最佳的 ChIP 结果,每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质(如第四部分中所测定)。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前,通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是,如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质,则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。
注意:Cell Signaling Technology 抗体在每份处于 1 和 2 ug 之间 IP 样品会取得最佳效果。当存在多份不同浓度的样品时,最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。
引物长度: | 24 个核苷酸 |
最佳 Tm: | 60℃ |
最佳 GC: | 50% |
扩增子尺寸: | 150 至 200 bp(标准 PCR) |
80 至 160 bp(实时荧光定量 PCR) |
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
无核酸酶的 H2O | 12.5 μl |
10X PCR 缓冲液 | 2.0 μl |
4mM dNTP 混合物 | 1.0 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2.0 μl |
Taq DNA 聚合酶 | 0.5 μl |
a. | 初始变性 | 95℃ | 5 分钟 |
b. | 变性 | 95℃ | 30 秒 |
c. | 复性 | 62℃ | 30 秒 |
d. | 延伸 | 72℃ | 30 秒 |
e. | 重复步骤 b-d,共循环 34 次。 | ||
f. | 终末延伸 | 72℃ | 5 分钟 |
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
无核酸酶的 H2O | 6 μl |
5 μM RPL30 引物 | 2 μl |
SYBR-Green Reaction Mix | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95℃ 3 分钟 |
b. | 变性 | 95℃ 15 秒 |
c. | 复性和延伸: | 60℃ 60 秒 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
使用实时 PCR 仪的自带软件,分析定量 PCR 结果。或者,可以使用input样品百分数方法和以下所示的公式,手动计算 IP 效率。采用这种方法,从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总input样品染色质的百分比。
输入百分比 = 2% x 2(C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品)
C[T] = CT = PCR 反应的阈周期
用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库,请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于 Illumina® 平台上测序,我们建议使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 及其相关索引引物 Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) #47538。
建议:
从组织样品收获交联的染色质时,组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织(类似于 4 x 106 个 Hela 细胞)制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围,该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型,使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是,与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比,用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织,原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果,我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质,因此,对于某些组织,每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。
组织/细胞 | 染色质总产率 | 预期 DNA 浓度 |
---|---|---|
脾 | 20-30 μg/25 mg 组织 | 200-300 μg/ml |
肝 | 10-15 μg/25 mg 组织 | 100-150 μg/ml |
肾 | 8-10 μg/25 mg 组织 | 80-100 μg/ml |
脑 | 2-5 μg/25 mg 组织 | 20-50 μg/ml |
心脏 | 2-5 μg/25 mg 组织 | 20-50 μg/ml |
Hela | 10-15 μg/4 x 106 个细胞 | 100-150 μg/ml |
将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。
问题 | 可能的原因 | 建议 |
---|---|---|
1. 消化的染色质浓度过低。 | 添加至染色质消化的细胞数不足,或者胞核在消化后未完全裂解。 | 如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml,则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg,然后继续实验。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量,和/或在声波处理前后在显微镜下观察胞核,以证实胞核完全裂解。 |
2. 染色质消化不足且片段过大(大于 900 bp)。 | 细胞可能已经过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。 向染色质消化中添加过多细胞或未添加足够的 Micrococcal Nuclease。 | 在甲醛浓度固定的情况下进行一段时间。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;有关染色质消化的优化,参见附录 B。 |
3. 染色质过度消化并且片段过小(只有 150 bp 单核小体的长度)。在 PCR 定量期间,将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能削弱信号,尤其对于长度大于 150 bp 的扩增子更是如此。 | 添加至染色质消化的细胞不足或 Micrococcal Nuclease 过多。 | 在交联之前计算备用平板上细胞的数量,以确定准确的细胞数量;有关染色质消化的优化,参见附录 B。 |
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。 | 添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。 PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。 添加至 IP 反应的染色质不足或染色质过度消化。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 使用来自交联并消化后的染色质的纯化 DNA,优化实验引物组的 PCR 条件。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到小于 150 碱基对(请参见第八部分中的引物设计建议)。 为获得最佳 ChIP 结果,每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。 |
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。 | 添加至 IP 反应的染色质或抗体不足,或者 IP 孵育时间过短。 蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。 | 确保向每次 IP 反应中添加 5-10 μg 染色质和 10 μl 抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加蛋白 G 微珠后需额外孵育 2 小时。 在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳,同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。 |
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。 | 添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者,添加至 IP 反应的抗体过多。 添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。 | 向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。 向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则,不能准确测量起始 DNA 数量的差异。 |
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。 | 添加至 PCR 反应的 DNA 不足。 添加至 IP 反应的抗体不足。 抗体不适用于 IP。 | 向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。 通常,需向 IP 反应中添加 1 至 5 µg 的抗体;但是,实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。 增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。 |
发布时间 2011 年 12 月
修订时间 2022 年 4 月
实验步骤编号:1184
! | ! 表示实验步骤中需要根据进行的 CUT&RUN 反应次数来调整体积的重要步骤。 |
!! | !! 表示需要在操作前稀释缓冲液的一个重要步骤。 |
安全停止 | 如果需要停止,这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
对于大多数细胞类型,活细胞可用于 CUT&RUN 检测,以产生强大的组蛋白、转录因子和辅因子富集。就某些对伴刀豆球蛋白 A 脆弱或敏感的细胞类型,略微固定细胞有助于保存细胞并保持它们完整。此外,如果使用新鲜细胞未观察到明显信号,固定可能有助于促进低丰度和/或弱结合转录因子和辅因子的富集。请注意,细胞的过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。
我们的 CUT&RUN 分析适用于广泛的细胞或组织。如实验步骤中定义,一个 CUT&RUN 反应可包含 5,000 至 个 250,000 细胞或 1 至 5 mg 的组织。整个实验步骤中使用的缓冲液体积无需根据每次反应的细胞或组织数量进行调整,只要在此范围内即可。当需要时,缓冲液体积确实需要根据正在执行的反应数量按比例增加。如果可能,我们建议每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织。如果细胞数量有限,我们建议每个反应至少使用 5,000 到 10,000 个细胞进行组蛋白修饰,每个反应至少使用 10,000 到 20,000 个细胞进行转录因子或辅因子。
注意: 推荐用于细胞透化的毛地黄皂苷的量是过量的,应该足以用于大多数细胞系和组织类型的通透。然而,并非所有细胞系和组织对毛地黄皂苷都表现出相同的敏感性。如果您的特定细胞系或组织在推荐的毛地黄皂苷浓度下不起作用,您可以按照附录 A 中提供的实验步骤来优化条件。毛地黄皂苷处理应导致 >90% 的细胞群通透。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意: 应在室温下连续进行活细胞(无固定)制备步骤,以尽量减少对细胞的压力。为了尽量减少 DNA 碎片,在重悬过程中避免剧烈涡旋和样品起泡。为 CUT&RUN 制备活细胞时,我们建议在制备细胞之前准备伴刀豆球蛋白 A 珠子(第 II 部分,步骤 1 到 5),以尽量减少细胞在珠子制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。
注:对于贴壁细胞,首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来,并用至少 3 体积的组织培养基中和。我们不建议从培养皿中刮取细胞,因为这会压迫甚至裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数,以确保用于实验的细胞数量正确。
注:处理低细胞数(<100,000 总细胞)的挑战在于,离心后的细胞颗粒并不总是肉眼可见,因此很容易在洗涤步骤中丢失细胞。因此,当处理低细胞数时,我们建议跳过下面的洗涤步骤 3 到 5。伴刀豆球蛋白 A 珠与细胞的结合耐受结合反应中有 40% 的细胞培养基。因此,在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后,可以去除大部分上清液,每次反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在步骤 6 中,向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液(+ 亚精胺 + PIC),使每次反应的总体积达到 100 µl。
注意:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
注:固定细胞制备需要以下试剂,不包含在此试剂盒中:37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606,甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注释:对于贴壁细胞系,首先需要使用胰蛋白酶将细胞从培养皿中分离出来,并用至少 3 体积的培养基中和。我们不建议从培养皿中刮取细胞,因为这会压迫甚至裂解细胞。应使用血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数,以确保用于实验的细胞数量正确。
注:处理低细胞数(<100,000 总细胞)的挑战在于,离心后的细胞颗粒并不总是肉眼可见,因此很容易在洗涤步骤中丢失细胞。在这种情况下,我们不建议冷冻细胞沉淀物。此外,当处理这些低细胞数时,我们建议跳过下面的洗涤步骤 5 到 7。伴刀豆球蛋白 A 珠与细胞的结合耐受结合反应中有 40% 的细胞培养基。因此,在步骤 4 中对细胞悬浮液进行初始离心后,可以去除大部分上清液,每次反应留下 ≤40 µl 细胞培养基。然后在步骤 8 中,向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液(+ 亚精胺 + PIC),使每次反应的总体积达到 100 µl。
注意:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
对于大多数组织类型,1 mg 轻微固定的组织(0.1% 甲醛,2 分钟)可以产生强大的组蛋白、转录因子和辅因子富集。富集组蛋白修饰不需要甲醛固定。然而,许多转录因子和辅因子确实需要对组织进行光固定以获得最佳结果。一些低丰度和/或弱结合转录因子和辅助因子可能需要中等固定(0.1% 甲醛,10 分钟)以获得最佳结果。此外,在使用具有挑战的组织类型(如纤维组织)时,中等固定可能会改善结果。请注意,过度固定会抑制 CUT&RUN 检测。固定的组织样本在使用前可以在 -80°C 下冷冻长达 6 个月。
注:为 CUT&RUN 准备新鲜组织(无固定)时,我们建议在制备组织之前制备伴刀豆球蛋白 A 珠(第二部分,步骤 1 到 5),以尽量减少细胞在珠子制备过程中停留的时间。活化的珠子可以储存在冰上直到准备使用。
注:固定组织制备需要以下试剂,不包含在此试剂盒中:37% 甲醛或 16% 无甲醇的甲醛 #12606、磷酸盐缓冲盐水 (PBS) #9872、甘氨酸溶液 (10X) #7005 和 10% SDS 溶液 #20533。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:对于某些转录因子或辅因子,或对于诸如纤维组织之类的困难组织类型,每个反应最多可使用 5 mg 组织而无需按比例放大试剂。
注意:我们建议对组织进行稍稍固定,因为这种条件最适合大多数组织类型和蛋白质靶标。但是,如果需要新鲜组织,请跳过步骤 3 到 8 并立即进行步骤 9。
注意:此体积的固定溶液足以容纳多达 50 mg 的组织。如果处理 >50 mg,则在步骤 7 中相应地增加固定溶液和 1X PBS + PIC 溶液。
注意:对于困难的组织类型(如纤维组织)或低丰度和/或弱结合转录因子或辅因子,将甲醛固定延长至 10 分钟可能会改善结果。
注意:在随后的实验步骤中,将在 55°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 1.5 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
NOTE: Digitonin Solution #16359 should be stored at -20°C. 请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注意:避免将伴刀豆球蛋白 A 珠悬浮液涡旋,因为反复涡旋可能会使伴刀豆球蛋白 A 从珠子中移位。
注意:为避免珠子丢失,请使用移液管去除液体。请勿使用真空设备抽吸。
注意:如果在细胞或组织制备之前制备伴刀豆球蛋白 A 珠子(如建议用于活细胞和新鲜组织),则活化的珠子可以储存在冰上直至使用。
注意:伴刀豆球蛋白 A 珠子可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。无需摇动或振摇样品样管。
注意:CUT&RUN 需要的抗体量不定,应由使用者确定。对于阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751,向样品中添加 2 µl 抗体。对于阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362,向样品中添加 5 µl。我们强烈建议使用阴性对照抗体,而不是非抗体对照,因为后者会导致高水平的非特异性 MNase 消化和高背景信号。我们建议尽可能使用 input 样本与 qPCR 和 NG-seq 分析进行比较。
注意:伴刀豆球蛋白 A 珠子可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。无需摇动或振摇样品样管。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
NOTE: The Digitonin Buffer prepared here will be used for both Section III and IV.
注意:Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。上下吹打来重悬珠子。无需摇动或振摇样品样管。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在进行的 CUT&RUN 反应次数按比例增加。
注意:洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
可选:如需对样品进行标准校对,则可将 Sample Normalization Spike-In DNA 添加到 1X Stop Buffer 中(例如,见第七部分的图 8)。对于 qPCR 分析,我们建议每次反应加入 5 µl (5 ng) Spike-In DNA。对于 NG-seq 分析,我们建议用 Nuclease-free Water #12931 稀释 Sample Normalization Spike-In DNA 100 倍,每次反应加入 5 µl (50 pg) Spike-In DNA。当每次反应使用 100,000 个细胞或 1 mg 组织时,这可确保标准化读数约为总测序读数的 0.5%。如果每个反应使用多于或少于 100,000 个的细胞或 1 mg 组织,按比例放大或缩小样本标准化 Spike-In DNA 的体积,以将标准化读数调整到总读数的 0.5% 左右。
注意:应在 4°C 的冷却块或冰箱中进行消化。冰的温度可低至 0°C,这可能会限制消化并降低信号。无需摇动或振摇样品样管。
注意:如果使用活细胞或新鲜组织(未固定)进行 CUT&RUN 测定,跳过步骤 14-15,然后立即进行步骤 16。
注意:在随后的实验步骤中,将在 65°C 下孵育 input 样品,因此建议使用一根可封盖的 2 ml 试管,以减少孵育过程出现蒸发。
注意:如果样品没有预热到室温,SDS 可能会从溶液中沉淀出来。
输入 DNA 的片段化是与下游 NG 测序兼容所必需的,但对于下游 qPCR 分析则不是必需的。如果没有超声波仪,我们建议使用未片段化的输入 DNA 进行 qPCR 分析;然而,输入 DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化,因为未片段化输入 DNA 的尺寸太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。如果没有超声波仪并且需要进行下游 NG 测序分析,则可以使用 CUT&RUN 正常 IgG 抗体样品作为阴性对照,尽管这并不理想,因为正常的富含 IgG 的样品可能会显示非特异性 DNA 富集。或者,使用 MNase 的输入 DNA 片段化实验步骤可在 https://cst-science.com/CUT-RUN-input-digestion 获得。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
注意:超声处理条件可能需要根据 附录 B 中的步骤通过测试不同的超声仪功率设置和/或超声处理持续时间来凭经验确定。最佳超声处理条件将产生大小从 100-600 bp 不等的染色质片段。使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探针的 VirTis Virsonic 100 超声波均质器/超声波仪以 5 组 15 秒脉冲进行超声处理,可充分碎裂input染色质。
如 VI - A 部分所述,使用 DNA 离心柱可从input和富集染色质样品中纯化 DNA,或如第 VI - B 部分所述,使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行纯化。使用 DNA 离心柱纯化简单快速,可很好地回收 35 bp 以上的 DNA 片段(图 7A,泳道 2)。苯酚/氯仿提取之后再行乙醇沉淀更加困难,但能很好地回收 35 bp 以下的 DNA 片段(图 7A,泳道 3);但如图 7B 所示,大多数在 CUT&RUN 检测中产生的 DNA 片段大于 35 bp。因此,DNA 离心柱提供一种快速简单的方法来纯化 > 98% 的所有 CUT&RUN DNA 片段。
在 NG-seq 分析之前,使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法可以对纯化的 DNA 进行定量。对于含 100,000 个细胞的 CUT&RUN 反应,一次转录因子和辅因子的 CUT&RUN 反应中,预期 DNA 产量为 0.5-10 ng,而在一次组蛋白修饰反应中则为 1-20 ng。
图 7. 比较使用离心柱或苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法进行的 DNA 纯化。(A) 将低量程 DNA 标准品混合物(泳道 1,未纯化)使用 DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN,CUT&Tag) #14209(泳道 2)或苯酚/氯仿提取后接乙醇沉淀法(泳道 3)纯化,并通过在 4% 琼脂糖凝胶上电泳来分离。如图所示,苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀能有效回收所有大小的 DNA 片段,而 DNA 离心柱仅能回收 ≥ 35 bp 的 DNA 片段。(B) 在使用 TCF4/TCF7L2 (C48H11) Rabbit mAb #2569 的 CUT&RUN 检测中使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA。使用一台Bioanalyzer (Agilent Technologies) 分析文库中 DNA 片段的大小。在构建期间添加到文库中的接头蛋白和条码序列的片段长度为 140 bp。因此,文库制备后,起始 35 bp 的 DNA 片段长度将变为 175 bp(图中用蓝色垂直线标注)。如图所示,总 CUT&RUN 富集 DNA 片段中不到 2% 短于 175 bp(起始长度 35 bp),提示 DNA 纯化离心柱足以捕获 > 98% 的总 CUT&RUN DNA 片段。
NOTE: DNA can be purified from input and enriched chromatin samples using the DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN, CUT&Tag) #14209 (not included in this kit) and the modified protocol below. 步骤 1-5 已修改,以符合向 300 µl input样品和富集染色质样品中添加 5 倍体积 (1.5 ml) DNA 结合缓冲液的要求。
注意:1 体积样品应使用 5 体积的 DNA 结合缓冲液。
注意:以下试剂是苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀所必需的,不包含在本试剂盒中:苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)、氯仿/异戊醇 (24:1)、3M 乙酸钠 (pH 5.2)、20 mg/ml 糖原、100% 乙醇、70% 乙醇和 1X TE 缓冲液或无核酸酶水 #12931。
注意:如果进行样品标准化,仅CUT&RUN 样品使用Sample Normalization Primer Set分析 。input DNA 不包含Normalization Spike-In DNA。
试剂 | 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl) |
---|---|
Nuclease-free H2O #12931 | 6 μl |
5 µM 引物 | 2 μl |
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 | 10 μl |
a. | 初始变性 | 95°C,3 分钟 |
b. | 变性 | 95°C,15 秒钟 |
c. | 退火和延伸 | 60°C,60 秒钟 |
d. | 重复步骤 b 和 c,共循环 40 次。 |
样品标准化引物组的 C[T] 值 | **qPCR 的标准化系数 | 标准化之前的信号(步骤 5 中计算出的输入百分比) | 标准化之后的信号 | |
样品 1 | 23.31 | 2(23.31-23.31)=1.00 | 24.4% | 24.4%/1.00=24.4% |
样品 2 | 24.24 | 2(23.31-24.24)=0.52 | 12.0% | 12.0%/0.52=23.1% |
样品 3 | 25.08 | 2(23.31-25.08)=0.29 | 6.28% | 6.28%/0.29=21.7% |
样品 4 | 26.30 | 2(23.31-26.30)=0.13 | 2.72% | 2.72%/0.13=20.9% |
**qPCR 的标准化系数 = 2(C[T] 选定样品 – C[T] 其他样品)
图 8. 应用添加的Spike-In DNA对 CUT&RUN 信号进行 qPCR 标准化分析。对数量渐减的 HCT116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 (上小图)或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499(下小图)进行 CUT&RUN 检测。使用 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP® Human Β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。 每份样品中免疫沉淀 DNA 的数量表示为与 100,000 个细胞的input染色质总量相对应的信号。左图中为非标准化的富集结果。在每次反应中,按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-In DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异,将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右图显示了标准化后的富集。
用这种试剂盒制备的免疫富集 DNA 样品直接兼容 NG-seq。要构建下游 NG-seq DNA 文库,请使用与您的下游测序平台兼容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。对于在 Illumina® 平台上测序,我们建议按照 CUT&RUN DNA 的实验步骤,使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 和 Multiplex Oligos for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #29580 或 #47538 进行测序。
与酵母对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 | 标准化之前与测试参考基因组对应的unique reads数 | NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母 reads数/其他样品的酵母unique reads数 | |
样品 1 | 219,275 | 219,275/219,275 = 1.00 | 5,077,747 | 5,077,747 X 1.00 = 5,077,747 |
样品 2 | 411,915 | 219,275/411,915 = 0.53 | 9,896,671 | 9,896,671 X 0.53 = 5,268,306 |
样品 3 | 816,235 | 219,275/816,235 = 0.27 | 17,842,773 | 17,842,773 X 0.27 = 4,793,320 |
样品 4 | 1,120,826 | 219,275/1,120,826 = 0.20 | 23,836,679 | 23,836,679 X 0.20 = 4,663,339 |
NGS 的标准化系数 = 选定样品的酵母unique reads数/其他样品的酵母unique reads数
在 CUT&RUN 实验步骤中,向缓冲液中添加洋地黄皂苷能促进细胞膜透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和胞核。因此,缓冲液中有足量的洋地黄皂苷对抗体和酶的成功结合以及靶向基因位点的消化至关重要。不同细胞系对毛地黄皂苷透化细胞显示不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系或组织进行透化,但您可以使用本实验步骤测试您的特定细胞系或组织。我们发现,添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害,因此无需生成浓度曲线。所以,进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。
注意:洋地黄皂苷溶液 #16359 应保存在 -20°C 下。请在使用过程中将其保存在冰上,并在实验完成后保存在 -20°C 下。
注意:如果肉眼看不到细胞沉淀,我们建议在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后,在不干扰细胞沉淀的情况下去除尽可能多的细胞培养基,并对每个反应留下一些细胞培养基。然后在步骤 3 中,向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液,使总体积达到 100 µl。
建议对input DNA 样品进行超声处理,因为 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (< 10 kb)。此外,片段化的基因组 DNA (< 1 kb) 可在 NG-seq 分析中用作阴性对照。应优化超声处理,以便input DNA 的长度为 100-600 bp。
我们建议使用input样品进行 NG-seq,因为它能方便且无偏倚的呈现细胞基因组。虽然 IgG 样品也可在 NG-seq 中用作阴性对照,但由于存在非特异性结合,它可能会显示基因组特定区域出现富集。非片段化input DNA 可用于 qPCR 分析。但必须使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化非片段化的 DNA。
! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的input样品的数量按比例增加。
注意:如果在处理低细胞数(<100,000 个细胞)时肉眼看不到离心后的细胞沉淀,我们建议跳过下面的洗涤步骤 3-5。在步骤 2 中对细胞悬浮液进行初始离心后,在不干扰细胞沉淀的情况下去除尽可能多的细胞培养基,并在每个反应中留下一些细胞培养基。然后在步骤 6 中,将足够的 1X 洗涤缓冲液添加到细胞悬液中,以便在每个被测试的超声处理条件下达到 100 µl 的体积。
主要:在步骤 9 中,在 55°C 下孵育样品,因此建议使用一个可封盖的 1.5 ml 管子,以减少孵育过程中出现蒸发。
有关详细的疑难解答指南,请访问 https://cst-science.com/troubleshooting-CUT-RUN
实验步骤编号:1884
人, 小鼠, 大鼠, 猴
鸡 , 非洲爪蟾蜍, 斑马鱼 , 牛 , 犬 , 猪 , 马, 豚鼠
使用与人 β-链蛋白 Ser37 周围残基相对应的合成肽,对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
β-联蛋白是 Wnt 信号转导通路中的一个关键下游效应子 (1)。它与脊椎动物的两个重要生物过程有关:早期胚胎发育 (2) 和肿瘤形成 (3)。CK1 可在 Ser45 位点磷酸化 β-Catenin。该磷酸化会导致 β-Catenin随后能被 GSK-3 磷酸化 (4-6)。GSK-3β 通过在 Ser33、Ser37 和 Thr41 位点磷酸化 β-Catenin以将其降解 (7)。这些位点发生突变会提高 β-Catenin的稳定性,并且已在多种肿瘤细胞系中发现了这些突变 (8)。
Non-phospho (Active) β-Catenin (Ser33/37/Thr41) (D13A1) Rabbit mAb 可特异性识别稳定的 β-链蛋白,即不被 GSK-3 磷酸化的蛋白在细胞间黏附和/或典型 Wnt 信号转导通路中具有功能性活性。
探索与本品相关的通路。
除非如以 CST 合法授权代表签署的书面形式另行明确同意,否则以下条款适用于 CST、其附属公司或其分销商提供的产品。除非 CST 合法授权代表以书面形式单独接受,否则任何附加于或异于此处所载条款和条件的客户条款和条件均被拒绝且无效。
产品用“仅供研究使用”或类似标示声明标示,并且尚未经 FDA 或其他国外或国内监管实体出于任何目的批准、准许或许可。客户不得出于任何诊断或治疗目的或以任何与产品标示声明相冲突的方式使用任何产品。CST 销售或许可的产品提供给作为最终用户的客户,且仅用于研究和开发用途。出于诊断、预防或治疗目的任何产品使用或出于转售(单独或作为成分)或其他商业目的的任何产品购买都要求来自 CST 的单独许可。客户 (a) 不得向任何第三方出售、许可、出借、捐赠或另行转让或提供任何本公司产品,无论单独或联合其他材料方式,或使用本公司产品制造任何商业产品,(b) 不得复制、修改、逆向工程、反编译、反汇编或另行尝试发现本公司产品的底层结构或技术,或出于开发与 CST 产品或服务竞争的任何产品或服务的目的使用本公司产品,(c) 不得从本公司产品改变或移除任何商标、商品名称、徽标、专利或版权声明或标记,(d) 仅应根据 CST 产品销售条款和任何适用文档使用本公司产品,以及 (e) 应就客户联系本公司产品所用的任何第三方产品或服务而言遵守任何许可、服务条款或类似协议。