Revision 4

#9936Store at -20C

1 个试剂盒

(7 x 20 microliters)

Cell Signaling Technology

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3 Trask LaneDanversMassachusetts01923USA
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
Product Includes Product # Quantity Mol. Wt Isotype/Source
IKKα (3G12) Mouse mAb 11930 20 µl 85 kDa Mouse IgG1
IKKβ (D30C6) Rabbit mAb 8943 20 µl 87 kDa Rabbit IgG
Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 2697 20 µl 85 IKK-alpha 87 IKK-beta kDa Rabbit IgG
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb 3033 20 µl 65 kDa Rabbit IgG
IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) 4814 20 µl 39 kDa Mouse IgG1
Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb 2859 20 µl 40 kDa Rabbit IgG
NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 8242 20 µl 65 kDa Rabbit IgG
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074 100 µl Goat 
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 7076 100 µl Horse 

Please visit cellsignal.com for individual component applications, species cross-reactivity, dilutions, protocols, and additional product information.

Description

The NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit contains reagents to examine the activation state and total protein levels of key proteins in the NF-κB pathway: IKKα, IKKβ, NF-κB p65/RelA, and IκBα. The kit contains enough primary and secondary antibodies to perform two Western blot experiments per primary antibody.

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

Background

The transcriptional nuclear factor κB (NF-κB)/Rel transcription factors are present in the cytosol in an inactive state, complexed with the inhibitory IκB proteins. Activation occurs via phosphorylation of IκBα at Ser32 and Ser36, resulting in the ubiquitin-mediated proteasome-dependent degradation of IκBα and the release and nuclear translocation of active NF-κB dimers. The regulation of IκBβ and IκBε is similar to that of IκBα, however, the phosphorylation and degradation of these proteins occurs with much slower kinetics. Phosphorylation of IκBβ occurs at Ser/Thr19 and Ser23, while IκBε can be phosphorylated at Ser18 and Ser22. The key regulatory step in this pathway involves activation of a high molecular weight IkappaB kinase (IKK) complex, consisting of three tightly associated IKK subunits. IKKα and IKKβ serve as the catalytic subunits of the kinase. Activation of IKK depends on phosphorylation at Ser177 and Ser181 in the activation loop of IKKβ (176 and 180 in IKKα). NF-κB-inducing kinase (NIK), TANK-binding kinase 1 (TBK1), and its homolog IKKε (IKKi), phosphorylate and activate IKKα and IKKβ.
The NF-κB family of transcription factors is comprised of five proteins in mammals, p65/RelA, c-Rel, RelB, NF-κB1 (p105/p50) and NF-κB2 (p100/p52). p105 and p100 are proteolytically processed to produce p50 and p52, respectively. The 50 kDa active form is produced through proteolytic processing following IKK-mediated phosphorylation of p105 at multiple sites (Ser922, 924, 928 and 933), while p100's processing to p52 is induced by phosphorylation of Ser864 and Ser868. The p50 and p52 products form dimeric complexes with Rel proteins, which are then able to bind DNA and regulate transcription. Phosphorylation of p65/RelA at Ser276 by PKA C and MSK1 enhances transcriptional activity. p65 phosphorylation at Ser536 regulates activation, nuclear localization, protein-protein interactions, and transcriptional activity. PMA-induced NF-κB transcriptional activity is dependent on the region of p65 containing the potential phosphorylation sites Ser457, Thr458, Thr464 and Ser468. Phosphorylation of Ser468 by GSK-3β inhibits basal p65 activity.

  1. Yamamoto, Y. and Gaynor, R.B. (2004) Trends Biochem. Sci. 29, 72-79.
  2. Ghosh, S. and Karin, M. (2002) Cell 109, S81-S96.
  3. Viatour, P. et al. (2005) Trends Biochem. Sci. 30, 43-52.
  4. Ho, C. et al. (2016) PLOS One 10,1-22.
  5. Beyaz S. et al. (2016) Nature 531, 53-58.

Background References

    Trademarks and Patents

    Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    XP is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
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    仅供研究使用。不得用于诊断流程。
    Revision 4
    #9936

    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit

    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 1 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb #3033 对经过 hTNF-α（20 ng/mL，5 分钟）处理的 HeLa 细胞的裂解物 (1.0 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的单一靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 2 Expand Image
    Immunoprecipitation of Phospho-NF-κB p65 (Ser536) from HeLa extracts treated with hTNF-α #8902 (20 ng/ml, 5 min). Lane 1 is 10% input, lane 2 is Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900, and lane 3 is Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb. Western blot analysis was performed using Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb. Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 3 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242 对 HeLa 细胞的裂解物 (1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的单一靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 4 Expand Image
    使用 IKKα (3G12) Mouse mAb（上图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图），对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 5 Expand Image
    使用 Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对来自 THP-1 细胞（用 TPA（#9905，80 nM 24 小时）分化并用 1 μg/ml LPS 处理所示时间）的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 6 Expand Image
    使用 Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb #2859（上图）、IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) #4814（中图）和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对未经处理或经过 IFNa（#36000，20 ng/ml，5 分钟）处理的各种细胞系提取物进行蛋白质印迹法分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 7 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（上）或 NF-κB p65 Antibody #3034（下）对 HeLa 细胞和 NIH/3T3 细胞（未处理或 TNF-α 处理（#2169，20 ng/ml 5 分钟））的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 8 Expand Image
    使用 IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) #4814（上图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹法分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 9 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后，与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®，在酶催化分解期间发光。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 10 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后，与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO*，它可在酶催化的分解期间发光。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 11 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对来自不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 12 Expand Image
    使用 IKKβ (D30C6) Rabbit mAb，对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 13 Expand Image
    使用 IKKα (3G12) Mouse mAb #11930（上图）或 β-actin (13E5) Rabbit mAb #4970（下图）对 HeLa 细胞提取物（泳道 1）或 IKKα 敲除型 HeLa 细胞（泳道 2）进行蛋白印迹分析。敲除型 HeLa 细胞中没有信号，这证实了抗体对 IKKα 的特异性。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 14 Expand Image
    使用 #2697（上图）或 IKKα (D3W6N) Rabbit mAb #61294、IKKβ (D30C6) Rabbit mAb #8943（中图）和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图），对未经处理或已经过 TNFa（#16789，20 ng/mL，10 分钟）和 Calyculin A（#9902，100 nM，10 分钟）处理的 HeLa 细胞提取物、对已经过 TPA（#4174，80 nM，16 小时）分化且未经处理和已经过 LPS (#14011，1 μg/ml，1 小时）处理的 THP-1 细胞提取物进行蛋白质印迹法分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 15 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（上）和 NF-κB p65 (C22B4) Rabbit mAb #4764（下）对 分化的 THP-1 细胞（用 TPA（#9905，80 nM 24 小时）且使用 1 μg/ml LPS 处理所示时间的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 16 Expand Image
    使用 Phospho-IκBα (Ser32/36) (5A5) Mouse mAb #9246（上）和 IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen)（下），对用 TPA 分化（#9905，80 nM，24 小时）后再用 1 μg/ml LPS 处理规定时长的 THP-1 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 17 Expand Image
    使用 IKKβ (D30C6) Rabbit mAb（上）和 GAPDH (14C10) Rabbit mAb #2118（下），对野生型 IKKα (-/-) 和 IKKβ (-/-) 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 18 Expand Image
    使用 IKKα (3G12) Mouse mAb（绿色），对 HCT116（表达水平高；左）和 IGROV-1（表达水平低；右）进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 19 Expand Image
    使用 Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人胆囊（慢性胆囊炎）进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 20 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（绿色）对 HeLa 细胞（经血清饥饿（左）或 TNF-α 处理（#8902 按 20 ng/ml 20 分钟，右））进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor® phalloidin 555（红色）标记。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 21 Expand Image
    对 Hela 细胞提取物的 IkBa 进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input，泳道 2 用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 进行沉淀，泳道 3 为 IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen)#4814。使用 IκBα Antibody #9242 进行蛋白质印迹。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 22 Expand Image
    在 SignalSlide® NF-κB p65 IHC Controls #12873（石蜡包埋的 HCT116 细胞（未处理（左）或用 hTNF-α #8902 处理（右））上使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 23 Expand Image
    使用 Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人结肠癌（未处理（左）或 λ 磷酸酶处理（右））进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 24 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线），对未经处理（蓝色）或已经过 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902 和 Calyculin A #9902（20 ng/ml 和 100 nM，15 分钟；绿色）处理的 Hela 细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 25 Expand Image
    使用 IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) 对石蜡包埋的人平滑肌瘤进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 26 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人慢性胆囊炎进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 27 Expand Image
    使用 Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人结肠癌进行免疫组织化学分析，显示其胞质定位。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 28 Expand Image
    使用 IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) 对石蜡包埋的人肺癌进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 29 Expand Image
    使用 NF-κB p65(D14E12) XP® Rabbit mAb（绿色）对 HT-1080 细胞（未处理（左）或用 hTNF-α #8902 处理（20 ng/ml，20 分钟）（右））进行共聚焦免疫荧光分析。使用 DY-554 phalloidin（红色）标记肌动蛋白纤丝。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 30 Expand Image
    使用 Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人肺（慢性支气管炎）进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 31 Expand Image
    使用 IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen) 对石蜡包埋的人肾腺癌进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 32 Expand Image
    与浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（红色）相比，使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb（蓝色）对 HeLa 细胞进行流式细胞分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 33 Expand Image
    在对照肽（左）或 Phospho-IKK-alpha/beta (Ser176/180) Blocking Peptide #1023（右）存在的情况下，使用 Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对石蜡包埋的人乳腺癌进行免疫组织化学分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 34 Expand Image
    使用 IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen)（红色），对未经处理（左）或经 TNF-α 处理（#8902，10 ng/ml，15 分钟，右）的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 35 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 后进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。本图显示整个 IL-8（NFκB 的一个已知靶标基因）范围内的结合作用（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他图）。欲知其他 ChIP-seq 情况，请下载产品说明书。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 36 Expand Image
    使用 IKK-α (Ser176/Ser180) phosphate Rabbit mAb 对 THP-1 细胞（未处理（蓝色）和用 TPA 和 LPS 处理（绿色））进行流式细胞分析。使用 Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #8885 作为二抗。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 37 Expand Image
    使用IκBα (L35A5) Mouse mAb (Amino-terminal Antigen)（实线）或浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415（虚线），对经过 TNF-α（#8902，10 ng/ml，5 分钟；蓝色，阴性）处理或未经处理（绿色，阳性）的 NIH/3T3 细胞进行流式细胞分析。Anti-mouse IgG (H+L)，F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 38 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 后进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体4（上图）内的结合，包括 NFκB 的已知靶标基因 IL-8（下图）（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他结果图）。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 39 Expand Image
    使用 Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb 对来自 TNF-α 处理和 Calyculin A 处理的 HeLa 细胞和 NIH/3T3 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 40 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 Hela 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 后进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human IκBα Promoter Primers #5552、人 IL-8 启动子引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 41 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。€‚使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在 NF-κB p65 的已知靶基因 LAMC2 内结合（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 42 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。€‚使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体 1（上图）内结合，包括 NF-κB p65 的已知靶基因 LAMC2（下图）（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 43 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN。使用人 LAMC2 上游引物和人 ITM2A 下游引物进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    NF-κB Pathway Antibody Sampler Kit: Image 44 Expand Image
    对 CHO 细胞提取物的 NF-kB p65 进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input，泳道 2 用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 进行沉淀，泳道 3 为 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242。使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb #6956 进行蛋白质印迹法分析。
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