Revision 1
Cell Signaling Technology

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3 Trask LaneDanversMassachusetts01923USA
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
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UniProt ID:

#Q04206

Entrez-Gene Id:

5970

Product Includes Quantity Reactivity MW(kDa) Isotype
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb 3033 100 µl H M R Hm Mk Pg 65 Rabbit IgG
NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 8242 100 µl H M R Hm Mk Dg 65 Rabbit IgG

Please visit cellsignal.com for individual component applications, species cross-reactivity, dilutions, protocols, and additional product information.

Description

PhosphoPlus® Duets from Cell Signaling Technology (CST) provide a means to assess protein activation status. Each Duet contains an activation-state and total protein antibody to your target of interest. These antibodies have been selected from CST's product offering based upon superior performance in specified applications.

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

Background

Transcription factors of the nuclear factor κB (NF-κB)/Rel family play a pivotal role in inflammatory and immune responses (1,2). There are five family members in mammals: RelA, c-Rel, RelB, NF-κB1 (p105/p50), and NF-κB2 (p100/p52). Both p105 and p100 are proteolytically processed by the proteasome to produce p50 and p52, respectively. Rel proteins bind p50 and p52 to form dimeric complexes that bind DNA and regulate transcription. In unstimulated cells, NF-κB is sequestered in the cytoplasm by IκB inhibitory proteins (3-5). NF-κB-activating agents can induce the phosphorylation of IκB proteins, targeting them for rapid degradation through the ubiquitin-proteasome pathway and releasing NF-κB to enter the nucleus where it regulates gene expression (6-8). NIK and IKKα (IKK1) regulate the phosphorylation and processing of NF-κB2 (p100) to produce p52, which translocates to the nucleus (9-11).

  1. Baeuerle, P.A. and Henkel, T. (1994) Annu Rev Immunol 12, 141-79.
  2. Baeuerle, P.A. and Baltimore, D. (1996) Cell 87, 13-20.
  3. Haskill, S. et al. (1991) Cell 65, 1281-9.
  4. Thompson, J.E. et al. (1995) Cell 80, 573-82.
  5. Whiteside, S.T. et al. (1997) EMBO J 16, 1413-26.
  6. Traenckner, E.B. et al. (1995) EMBO J 14, 2876-83.
  7. Scherer, D.C. et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 11259-63.
  8. Chen, Z.J. et al. (1996) Cell 84, 853-62.
  9. Senftleben, U. et al. (2001) Science 293, 1495-9.
  10. Coope, H.J. et al. (2002) EMBO J 21, 5375-85.
  11. Xiao, G. et al. (2001) Mol Cell 7, 401-9.

Background References

    Trademarks and Patents

    Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    PhosphoPlus is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
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    限制使用

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    仅供研究使用。不得用于诊断流程。
    Revision 1
    #8214

    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet

    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 1 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb #3033 对经过 hTNF-α（20 ng/mL，5 分钟）处理的 HeLa 细胞的裂解物 (1.0 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的单一靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 2 Expand Image
    Immunoprecipitation of Phospho-NF-κB p65 (Ser536) from HeLa extracts treated with hTNF-α #8902 (20 ng/ml, 5 min). Lane 1 is 10% input, lane 2 is Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900, and lane 3 is Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb. Western blot analysis was performed using Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb. Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 3 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242 对 HeLa 细胞的裂解物 (1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的单一靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 4 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（上）或 NF-κB p65 Antibody #3034（下）对 HeLa 细胞和 NIH/3T3 细胞（未处理或 TNF-α 处理（#2169，20 ng/ml 5 分钟））的提取物进行蛋白质印迹分析。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 5 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对来自不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 6 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（上）和 NF-κB p65 (C22B4) Rabbit mAb #4764（下）对 分化的 THP-1 细胞（用 TPA（#9905，80 nM 24 小时）且使用 1 μg/ml LPS 处理所示时间的提取物进行蛋白质印迹分析。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 7 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（绿色）对 HeLa 细胞（经血清饥饿（左）或 TNF-α 处理（#8902 按 20 ng/ml 20 分钟，右））进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor® phalloidin 555（红色）标记。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 8 Expand Image
    在 SignalSlide® NF-κB p65 IHC Controls #12873（石蜡包埋的 HCT116 细胞（未处理（左）或用 hTNF-α #8902 处理（右））上使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行免疫组织化学分析。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 9 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线），对未经处理（蓝色）或已经过 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902 和 Calyculin A #9902（20 ng/ml 和 100 nM，15 分钟；绿色）处理的 Hela 细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 10 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人慢性胆囊炎进行免疫组织化学分析。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 11 Expand Image
    使用 NF-κB p65(D14E12) XP® Rabbit mAb（绿色）对 HT-1080 细胞（未处理（左）或用 hTNF-α #8902 处理（20 ng/ml，20 分钟）（右））进行共聚焦免疫荧光分析。使用 DY-554 phalloidin（红色）标记肌动蛋白纤丝。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 12 Expand Image
    与浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（红色）相比，使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb（蓝色）对 HeLa 细胞进行流式细胞分析。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 13 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 后进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。本图显示整个 IL-8（NFκB 的一个已知靶标基因）范围内的结合作用（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他图）。欲知其他 ChIP-seq 情况，请下载产品说明书。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 14 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 后进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体4（上图）内的结合，包括 NFκB 的已知靶标基因 IL-8（下图）（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他结果图）。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 15 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 Hela 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 后进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human IκBα Promoter Primers #5552、人 IL-8 启动子引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 16 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。€‚使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在 NF-κB p65 的已知靶基因 LAMC2 内结合（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 17 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。€‚使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体 1（上图）内结合，包括 NF-κB p65 的已知靶基因 LAMC2（下图）（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 18 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN。使用人 LAMC2 上游引物和人 ITM2A 下游引物进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    PhosphoPlus® NF-κB p65/RelA (Ser536) Antibody Duet: Image 19 Expand Image
    对 CHO 细胞提取物的 NF-kB p65 进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input，泳道 2 用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 进行沉淀，泳道 3 为 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242。使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb #6956 进行蛋白质印迹法分析。
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