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3 Trask LaneDanversMassachusetts01923USA
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
Product Includes Product # Quantity Mol. Wt Isotype/Source
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb 3033 20 µl 65 kDa Rabbit IgG
Acetyl-NF-κB p65 (Lys310) (D2S3J) Rabbit mAb 12629 20 µl 65 kDa Rabbit IgG
NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb 6956 20 µl 65 kDa Mouse IgG2b
NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 8242 20 µl 65 kDa Rabbit IgG
Phospho-NF-κB p65 (Ser468) Antibody 3039 20 µl 65 kDa Rabbit 
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074 100 µl Goat 
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody 7076 100 µl Horse 

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Description

The NF-κB p65 Antibody Sampler Kit contains reagents to examine NF-κB p65/RelA phosphorylation at Ser468 and Ser536; acetylation at Lys310; and total p65 levels.

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

Background

Transcription factors of the nuclear factor κB (NF-κB)/Rel family play a pivotal role in inflammatory and immune responses (1,2). There are five family members in mammals: RelA, c-Rel, RelB, NF-κB1 (p105/p50), and NF-κB2 (p100/p52). Both p105 and p100 are proteolytically processed by the proteasome to produce p50 and p52, respectively. Rel proteins bind p50 and p52 to form dimeric complexes that bind DNA and regulate transcription. In unstimulated cells, NF-κB is sequestered in the cytoplasm by IκB inhibitory proteins (3-5). NF-κB-activating agents can induce the phosphorylation of IκB proteins, targeting them for rapid degradation through the ubiquitin-proteasome pathway and releasing NF-κB to enter the nucleus where it regulates gene expression (6-8). NIK and IKKα (IKK1) regulate the phosphorylation and processing of NF-κB2 (p100) to produce p52, which translocates to the nucleus (9-11).
RelA/p65 is a subunit of the NF-κB transcription complex, which plays a crucial role in inflammatory and immune responses. The complex is composed of various homodimeric and heterodimeric Rel family member combinations, the activity of which is modulated by post-translational modifications including phosphorylation and acetylation. p65 phosphorylation by PKA and/or MSK1 at Ser276 allows for increased interaction with the transcriptional coactivator p300/CBP to enhance transcriptional activity. NF-κB dimer assembly with IκB, as well as its DNA binding and transcriptional activities, are regulated by p300/CBP acetyltransferases that principally target Lys218, Lys221 and Lys310 (12-14). This process is reciprocally regulated by histone deacetylases (HDACs); several HDAC inhibitors have been shown to activate NF-κB (12-14). T-cell co-stimulation and Calyculin A have both been shown to increase Ser468 phosphorylation (15,16). IKKβ (but not IKKα) and GSK-3β both target this site (16,17), which appears to have a negative regulatory role not involving inhibition of nuclear translocation after TNF-α or IL-1β stimulation (17). p65 phosphorylation at Ser536 regulates activation, nuclear localization, protein-protein interactions, transcriptional activity, and apoptosis (18-22).

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Background References

    Trademarks and Patents

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    仅供研究使用。不得用于诊断流程。
    Revision 1
    #4767

    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit

    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 1 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb #3033 对经过 hTNF-α（20 ng/mL，5 分钟）处理的 HeLa 细胞的裂解物 (1.0 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的单一靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 2 Expand Image
    Immunoprecipitation of Phospho-NF-κB p65 (Ser536) from HeLa extracts treated with hTNF-α #8902 (20 ng/ml, 5 min). Lane 1 is 10% input, lane 2 is Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900, and lane 3 is Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb. Western blot analysis was performed using Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb. Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 3 Expand Image
    对 HeLa 细胞提取物的 NF-kB p65 进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input，泳道 2 用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 进行沉淀，泳道 3 为 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb #6956。使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242 进行蛋白质印迹法分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 4 Expand Image

    对 HeLa 细胞提取物的 NF-kB p65 进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input，泳道 2 用 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 进行沉淀，泳道 3 为 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb #6956。使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242 进行蛋白质印迹法分析。

    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 5 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242 对 HeLa 细胞的裂解物 (1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的单一靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 6 Expand Image
    使用 Acetyl-NF-κB p65 (Lys310) (D2S3J) Rabbit mAb（上）或 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242（下），对 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析，而 293T 细胞经转染空载 (-) 或使用构建表达 Myc/DDK 标记的人类 NF-κB p65（hNF-κB p65；+）和 HA 标记的人类 p300（hp300-HA；+）进行转染。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 7 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（上）或 NF-κB p65 Antibody #3034（下）对 HeLa 细胞和 NIH/3T3 细胞（未处理或 TNF-α 处理（#2169，20 ng/ml 5 分钟））的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 8 Expand Image
    使用 Phospho-NF-kappaB p65 (Ser468) Antibody（顶部）或 NF-kappaB p65 Antibody #3034（底部）对来自 HeLa 细胞（用 TNF-α #2169 (20 ng/ml)、Calyculin A #9902 (50 nM) 或两种化合物处理 5 分钟）的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 9 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb #6956（上图）或 β-actin (13E5) Rabbit mAb #4970 （下图）对对照 HeLa 细胞（泳道 1） 或 NF-κB p65 敲除型 HeLa 细胞（泳道 2）的提取物进行蛋白质印迹法分析。NF-κB p65 敲除型 HeLa 细胞中没有信号，这证实了该抗体对 NF-κB p65 的特异性。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 10 Expand Image
    以浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415（虚线）作为对照，使用 NF-kB p65 (L8F6) Mouse mAb（实线）对 MCF7 细胞进行流式细胞分析。Anti-mouse IgG (H+L)，F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 11 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后，与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®，在酶催化分解期间发光。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 12 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后，与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO*，它可在酶催化的分解期间发光。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 13 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对来自不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 14 Expand Image
    使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（泳道 2）或 Acetyl-NF-κB p65 (Lys310) (D2S3J) Rabbit mAb（泳道 3），对 293T 细胞的乙酰基 NF-κB p65 (Lys310) 进行免疫沉淀，而 293T 细胞使用 Myc/DDK 标记的人类 NF-κB p65、HA 标记的人类 p300 进行共同转染。泳道 1 是 10% 输入对照。使用 Acetyl-NF-κB p65 (Lys310) (D2S3J) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 15 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（上）和 NF-κB p65 (C22B4) Rabbit mAb #4764（下）对 分化的 THP-1 细胞（用 TPA（#9905，80 nM 24 小时）且使用 1 μg/ml LPS 处理所示时间的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 16 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb（上）或 α-Tubulin (11Η10) Rabbit mAb #2125（下）时，对来自 HeLa 细胞（用 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-) 或 SignalSilence® NF-κB p65 siRNA I #6261 (+) 转染）的提取物进行蛋白质印迹分析。NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb 证实 NF-κB p65 表达沉默，而使用 α-Tubulin (11Η10) Rabbit mAb 作为内参对照。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 17 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（绿色）对 HeLa 细胞（经血清饥饿（左）或 TNF-α 处理（#8902 按 20 ng/ml 20 分钟，右））进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝已用 Alexa Fluor® phalloidin 555（红色）标记。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 18 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb 对来自不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 19 Expand Image
    在 SignalSlide® NF-κB p65 IHC Controls #12873（石蜡包埋的 HCT116 细胞（未处理（左）或用 hTNF-α #8902 处理（右））上使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行免疫组织化学分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 20 Expand Image
    使用 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（虚线），对未经处理（蓝色）或已经过 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902 和 Calyculin A #9902（20 ng/ml 和 100 nM，15 分钟；绿色）处理的 Hela 细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 21 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb 对人慢性胆囊炎组织进行免疫组织化学分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 22 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人慢性胆囊炎进行免疫组织化学分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 23 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb 对石蜡包埋的 OVCAR8 细胞沉淀物（用 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902 处理（左）或用 SignalSilence® NF-κB p65 siRNA I #6261 处理（右））进行免疫组织化学分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 24 Expand Image
    使用 NF-κB p65(D14E12) XP® Rabbit mAb（绿色）对 HT-1080 细胞（未处理（左）或用 hTNF-α #8902 处理（20 ng/ml，20 分钟）（右））进行共聚焦免疫荧光分析。使用 DY-554 phalloidin（红色）标记肌动蛋白纤丝。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 25 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb 对石蜡包埋的 HeLa 细胞沉淀物（未处理（左）或用 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902 处理（右））进行免疫组织化学分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 26 Expand Image
    与浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900（红色）相比，使用 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb（蓝色）对 HeLa 细胞进行流式细胞分析。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 27 Expand Image
    使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb（绿色）对 HeLa 细胞（未处理（左）或用 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902 处理（20 ng/mL，20 分钟；右））进行共聚焦免疫荧光分析。使用 DY-554 phalloidin（红色）标记肌动蛋白纤丝。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084（DNA 荧光染料）。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 28 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 后进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。本图显示整个 IL-8（NFκB 的一个已知靶标基因）范围内的结合作用（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他图）。欲知其他 ChIP-seq 情况，请下载产品说明书。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 29 Expand Image
    以浓度匹配的 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415（虚线）作为对照，使用 NF-kB p65 (L8F6) Mouse mAb（实线）对 MCF7 细胞 进行流式细胞分析。使用 Anti-mouse IgG (H+L)， F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4408 作为二抗。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 30 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 后进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体4（上图）内的结合，包括 NFκB 的已知靶标基因 IL-8（下图）（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他结果图）。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 31 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003，对经 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 后进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human IκBα Promoter Primers #5552、人 IL-8 启动子引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 32 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003，对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 Hela 细胞中提取的交联染色质，在加入 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 后进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human IκBα Promoter Primers #5552、人 IL-8 启动子引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 33 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。€‚使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在 NF-κB p65 的已知靶基因 LAMC2 内结合（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 34 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。€‚使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体 1（上图）内结合，包括 NF-κB p65 的已知靶基因 LAMC2（下图）（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 35 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 对经 hTNF-α #8902（30 ng/ml，1 小时）处理的 HeLa 细胞和 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN。使用人 LAMC2 上游引物和人 ITM2A 下游引物进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    NF-κB p65 Antibody Sampler Kit: Image 36 Expand Image
    对 CHO 细胞提取物的 NF-kB p65 进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input，泳道 2 用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 进行沉淀，泳道 3 为 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb #8242。使用 NF-κB p65 (L8F6) Mouse mAb #6956 进行蛋白质印迹法分析。
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