Revision 1

#98110Store at -20C

1 个试剂盒

(6 x 20 microliters)

Cell Signaling Technology

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Web: [email protected] cellsignal.com

3 Trask LaneDanversMassachusetts01923USA
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
Product Includes Product # Quantity Mol. Wt Isotype/Source
RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb 3493 20 µl 78 kDa Rabbit IgG
Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb 65746 20 µl 78-82 kDa Rabbit IgG
MLKL (D2I6N) Rabbit mAb 14993 20 µl 54 kDa Rabbit IgG
Phospho-MLKL (Ser358) (D6H3V) Rabbit mAb 91689 20 µl 54 kDa Rabbit IgG
RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb 13526 20 µl 46-62 kDa Rabbit IgG
Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb 93654 20 µl 46-62 kDa Rabbit IgG
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074 100 µl Goat 

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Description

The Necroptosis Antibody Sampler Kit provides an economical means of detecting total and phosphorylated proteins associated with necroptosis. The kit includes enough antibody to perform two western blots with each primary antibody.

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

Background

Necroptosis, a regulated pathway for necrotic cell death, is triggered by a number of inflammatory signals, including cytokines in the tumor necrosis factor (TNF) family, pathogen sensors such as toll-like receptors (TLRs), ischemic injury, and neurodegenerative diseases (1-3). The process is negatively regulated by caspases and is initiated through a complex containing the RIP and RIP3 kinases, typically referred to as the necrosome. Necroptosis is inhibited by a small molecule inhibitor of RIP, necrostatin-1 (Nec-1) (4). RIP is phosphorylated at several sites within the kinase domain that are sensitive to Nec-1, including Ser14, Ser15, Ser161, and Ser166 (5). During necroptosis, RIP3 is phosphorylated at Ser227, leading to recruitment and phosphorylation of MLKL at Thr357 and Ser358 (6). Phosphorylation of MLKL results in its oligomerization and translocation to the plasma membrane, where it affects membrane integrity (7-10).

  1. Christofferson, D.E. and Yuan, J. (2010) Curr Opin Cell Biol 22, 263-8.
  2. Kaczmarek, A. et al. (2013) Immunity 38, 209-23.
  3. Zhou, W. and Yuan, J. (2014) Semin Cell Dev Biol 35, 14-23.
  4. Degterev, A. et al. (2008) Nat Chem Biol 4, 313-21.
  5. Ofengeim, D. and Yuan, J. (2013) Nat Rev Mol Cell Biol 14, 727-36.
  6. Sun, L. et al. (2012) Cell 148, 213-27.
  7. Cai, Z. et al. (2014) Nat Cell Biol 16, 55-65.
  8. Chen, X. et al. (2014) Cell Res 24, 105-21.
  9. Wang, H. et al. (2014) Mol Cell 54, 133-46.
  10. Dondelinger, Y. et al. (2014) Cell Rep 7, 971-81.

Background References

    Trademarks and Patents

    Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    XP is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
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    Revision 1
    #98110

    Necroptosis Antibody Sampler Kit

    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 1 Expand Image
    使用 Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb #65746 对经过 ZVAD(20uM,7.5 小时)+ hTNF-α(20ng/mL,7 小时)+ SM-164(100nM,7 小时)处理的 HT-29 细胞的裂解物 (0.1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像(左图)显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的靶标条带(如图所示)。对应的电泳图(右图)为一抗稀释比例在 1:10(蓝线)和 1:50(绿线)时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下,使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple(BioTechne 品牌)的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 2 Expand Image
    使用 RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb(上图)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图),对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 3 Expand Image
    使用 MLKL (D2I6N) Rabbit mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。KARPAS 细胞系来源:剑桥大学的 Abraham Karpas 博士。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 4 Expand Image
    使用 RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb 对未转染或转染人 RIP 表达载体的 Hela 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 5 Expand Image
    使用 Phospho-RIP (Ser166) (D1L3S) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对未经处理 (-) 或经过如下所示的处理组合方法处理的 HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析:Z-VAD(20 μM,先于其他混合物 30 分钟添加;+)、人 TNF-α(hTNF-α,20 ng/ml,7 小时;+)、SM-164(100 nM,7 小时;+)和 necrostatin-1(Nec-1,50 μM,7 小时;+)。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 6 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后,与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®,在酶催化分解期间发光。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 7 Expand Image
    使用 Phospho-MLKL (Ser358) (D6H3V) Rabbit mAb(上图)或 MLKL (D2I6N) Rabbit mAb #14993(下图)对未经处理 (-) 或经过如下所示的处理组合方法处理的 HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析:Z-VAD(20 μM,先于其他混合物 30 分钟添加;+)、人 TNF-α(hTNF-α,20 ng/ml,7 小时;+)、SM-164(100 nM,7 小时;+)和 necrostatin-1(Nec-1,50 μM,7 小时;+)。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 8 Expand Image
    使用 Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb 对未经处理 (-) 或经过如下所示的处理组合方法处理的 HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析:Z-VAD(20 μM,先于其他混合物 30 分钟添加;+)、人 Tumor Necrosis Factor-α #8902(hTNF-α,20 ng/ml,7 小时;+)、SM-164(100 nM,7 小时;+)。膜不用(左图)或用牛小肠磷酸酶处理(CIP;右图),以确定磷酸特异性。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 9 Expand Image
    使用 RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb 对转染空载 (-) 或转染全长人 RIP3 蛋白 (hRIP3; +) 表达载体的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 10 Expand Image
    使用 MLKL (D2I6N) Rabbit mAb (上)或 Myc-Tag (71D10) Rabbit mAb #2278(下),对转染空载 (-) 转染 Myc/DDK 标签的全长人 MLKL 蛋白表达载体 (hMLKL-Myc/DDK;+) 的 293T 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 11 Expand Image
    使用 RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb(绿色)对 OVCAR8 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 12 Expand Image
    使用 Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb(上图),RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb #13526(中图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对未经处理 (-) 或经过如下所示的处理组合方法处理的 HT-29 细胞进行蛋白质印迹分析:Z-VAD(20 μM,先于其他混合物 30 分钟添加;+)、人 Tumor Necrosis Factor-α #8902(hTNF-α, 20 ng/ml,7 小时;+)、SM-164(100 nM,7 小时;+)和 necrostatin-1(Nec-1,50 μM, 7小时;+)。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 13 Expand Image
    使用 RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb(实线)或 浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线)对对照型 MEF 细胞(绿色)或 RIP 敲除型 MEF 细胞(蓝色)进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 14 Expand Image
    使用 Phospho-RIP3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb(上图)、RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAb #13526(中图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对未经处理 (-) 或经过以下所示的处理方法组合处理的 HT-29 细胞 或 HT-29 RIPK1 KO 细胞进行蛋白质印迹分析:Z-VAD (20 μM,先于其他化合物之前 30分钟添加;+)、Human Tumor Necrosis Factor-α #8902(hTNF-α,20 ng/ml,7 小时;+) 和 SM-164(100 nM,7 小时;+)。HT-29 RIPK1 KO 细胞由马萨诸塞州波士顿哈佛大学医学院的 Junying Yuan 博士惠赠。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 15 Expand Image
    使用 RIP (D94C12) XP® Rabbit mAb #3493 对 Ramos 细胞的裂解物 (0.1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像(左图)显示一抗稀释比例为 1:50 和 1:250 时的单一靶标条带(如图所示)。相应的电泳图视图(右图)描绘了一抗稀释比例为 1:50(绿色线)和 1:250(蓝色线)时沿毛细血管的按分子量的化学发光结果。在还原条件下,使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple(BioTechne 品牌)的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    Necroptosis Antibody Sampler Kit: Image 16 Expand Image
    使用 Phospho-RIPK3 (Ser227) (D6W2T) Rabbit mAb(绿色)对未处理的(左图)、经 Z-VAD(20 μM,30 分钟)预处理后再经 SM-164 (100 nM) 和 Human Tumor Necrosis Factor-α (hTNF-α) #8902(20 ng/mL,6 小时;中间)处理,或经 Z-VAD 预处理后再经 SM-164 和 hTNF-α 处理,随后经 λ 磷酸酶后处理(右图)的 HT-29 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白微丝由 DyLight 554 Phalloidin #13054(红色)标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。