Revision 1

#39433Store at -20C

1 个试剂盒

(6 x 20 microliters)

Cell Signaling Technology

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Support: 877-678-TECH (8324)

Web: [email protected] cellsignal.com

3 Trask LaneDanversMassachusetts01923USA
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
Product Includes Product # Quantity Mol. Wt Isotype/Source
MyD88 (D80F5) Rabbit mAb 4283 20 µl 33 kDa Rabbit IgG
IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb 4504 20 µl 78-105 kDa Rabbit IgG
IRAK2 Antibody 4367 20 µl 62 kDa Rabbit 
IRAK4 Antibody 4363 20 µl 55 kDa Rabbit 
Phospho-IRAK4 (Thr345/Ser346) (D6D7) Rabbit mAb 11927 20 µl 55 kDa Rabbit IgG
TRAF6 (E2K9D) Rabbit mAb 67591 20 µl 60 kDa Rabbit IgG
TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb 38066 20 µl 84 kDa Rabbit IgG
Phospho-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2) XP® Rabbit mAb 5483 20 µl 84 kDa Rabbit IgG
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074 100 µl Goat 

Please visit cellsignal.com for individual component applications, species cross-reactivity, dilutions, protocols, and additional product information.

Description

The Myddosome Complex Antibody Sampler Kit provides an economical means of detecting the components of the myddosome complex using phospho-specific and control antibodies. The kit includes enough antibodies to perform two western blot experiments with each primary antibody.

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibodies.

Background

Toll-like receptors (TLRs) are a large family of so-called pattern recognition receptors (PRRs) that detect pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and danger associated molecular patterns (DAMPs) (1,2). Upon activation, TLRs initiate two main signaling pathways through their C-terminal cytoplasmic Toll/Il-1 receptor (TIR) domain that couples with TIR domain-containing adaptors MyD88 and TRIF. The MyD88-dependent pathway is initiated by the formation of a large oligomeric protein complex termed myddosome. Myddosome is one of so-called supramolecular organizing centers (SMOCs), a signaling organelle that is common for PRRs in the innate immune system. Myddosome formation promotes IRAK4 activation, which in turn activates IRAK1 and later, IRAK2. TRAF6 is then recruited and activated through the binding sites within IRAKs. Activated TRAF6 is released to the cytosol and triggers the IKK complex to activate the NF-κB pathway to mediate the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines (3-7). Recently, it was also found that TBK1 is recruited to the myddosome complex and activated to induce aerobic glycolysis (8).

  1. Behzadi, P. et al. (2021) J Immunol Res 2021, 9914854.
  2. Aluri, J. et al. (2021) Cells 10, 1374. doi: 10.3390/cells10061374.
  3. De Nardo, D. (2015) Cytokine 74, 181-9.
  4. Latty, S.L. et al. (2018) Elife 7:e31377. doi: 10.7554/eLife.31377.
  5. De Nardo, D. et al. (2018) J Biol Chem 293, 15195-15207.
  6. Balka, K.R. and De Nardo, D. (2019) J Leukoc Biol 105, 339-351.
  7. Gold, J.J. et al. (1988) Biosystems 21, 403-15.
  8. Tan, Y. and Kagan, J.C. (2019) Cell 177, 384-398.e11.

Background References

    Trademarks and Patents

    Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    XP is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    All other trademarks are the property of their respective owners. Visit cellsignal.com/trademarks for more information.

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    Revision 1
    #39433

    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit

    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 1 Expand Image
    使用 IRAK4 Antibody #4363 对 THP-1 细胞的裂解物 (0.1 mg/mL) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像(左图)显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的靶标条带(如图所示)。对应的电泳图(右图)为一抗稀释比例在 1:10(蓝线)和 1:50(绿线)时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下,使用 12-230 kDa 分离模块在 ProteinSimple(BioTechne 品牌)的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 2 Expand Image
    使用 Phospho-IRAK4 (Thr345/Ser346) (D6D7) Rabbit mAb (上图) 或 IRAK4 Antibody #4363 (下图),对未经处理的 (-) 或经 Human Interleukin-1β (hIL-1β) #8900(50ng/ml,15分钟;+) 处理的血清饥饿 KARPAS-299 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。细胞系资料来源:剑桥大学的 Abraham Karpas 博士。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 3 Expand Image
    使用 TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对野生型 (+/+) 或 TBK1/NAK 敲除型 (-/-) HCT 116 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 4 Expand Image
    使用 MyD88 (D80F5) Rabbit mAb 对 Raji、A549 和 THP-1 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 5 Expand Image
    使用 IRAK4 Antibody 对 THP-1(人)、RAW 264.7(小鼠)和 H-4-II-E(大鼠)细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 6 Expand Image
    使用 IRAK2 Antibody #4367对 Jurkat、Raji 和 K562 细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 7 Expand Image
    使用 IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb 对 RD、293 和 A20 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 8 Expand Image
    使用 Phospho-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2) XP® Rabbit mAb(上图)或总 TBK1/NAK (D1B4) Rabbit mAb #3504(下图)对用 TPA #4174(80 nM,过夜)分化后用 LPS (1 μg/ml) 处理长达 24 小时的 THP-1 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 9 Expand Image
    使用 TRAF6 (E2K9D) Rabbit mAb(上图)和 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图)对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。NCI-H23 细胞中信号的缺失由 RNAseq 预测,并证实了抗体的特异性。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 10 Expand Image
    对 K-562 细胞提取物 TRAF6 蛋白进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900,泳道 3 为 TRAF6 (E2K9D) Rabbit mAb。使用 TRAF6 (E2K9D) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹法分析。Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127 用作二抗。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 11 Expand Image
    对 A20 细胞提取物 TRAF6 蛋白进行免疫沉淀分析。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900,泳道 3 为 TRAF6 (E2K9D) Rabbit mAb。使用 TRAF6 (E2K9D) Rabbit mAb 进行蛋白质印迹法分析。Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) #5127 用作二抗。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 12 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后,与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®,在酶催化分解期间发光。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 13 Expand Image
    使用 TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对不同细胞系的提取物进行蛋白印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 14 Expand Image
    使用 MyD88 (D80F5) Rabbit mAb 对未经转染 () 或经 MyD88 siRNA 转染 (+) 的 A549 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 15 Expand Image
    使用 IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb 对转染空载或经人 IRAK1 转染的 COS-7 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 16 Expand Image
    使用 Phospho-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2) XP® Rabbit mAb(上图)或总 TBK1/NAK (D1B4) Rabbit mAb #3504(下图)对用 TPA #4174(80 nM,过夜)分化后用 LPS(1 μg/ml,1 小时)处理、未经处理或已经磷酸酶处理的 THP-1 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 17 Expand Image
    对 Raji 细胞提取物 TBK1/NAK 进行免疫沉淀。泳道 1 为 10% input,泳道 2 为Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900,泳道 3 为 TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb。使用 TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb 进行蛋白印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 18 Expand Image
    使用 TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb 对 WT(左图)或 TBK1 KO(右图)的 U20S 提取物进行蛋白质印迹法分析。用 Ponceau S 染色的膜进行总蛋白标准化(下图)。这些数据由 YCharOS Inc. 提供,该公司是一家开放科学公司,作为 CST 科学家生成的验证数据的合作伙伴,其使命是表征市售抗体。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 19 Expand Image
    使用 IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb 对 THP-1、小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)、RAW264.7 和 NIH/3T3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 20 Expand Image
    使用 Phospho-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2) XP® Rabbit mAb(绿色)对用 TPA #4174(80nM,过夜)(左图)处理后用 LPS(1μg/ml,1 小时)(中图)处理或用 LPS 和 λ 磷酸酶处理(右图)的 THP-1 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 DY-554 Phalloidin(红色)标记。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 21 Expand Image
    使用 TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb(绿色)对野生型(左图,阳性)或 TBK1/NAK 敲除型(右图,阴性)HCT 116 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝已带有 Alexa Fluor® 555 Phalloidin #8953(红色)标记。样本用 ProLong® Gold Antifade Reagent with DAPI #8961(蓝色)封片。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 22 Expand Image
    使用 IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb #4504(上)或 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb #2125(下)对经 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® IRAK1 siRNA I (+) 或 SignalSilence® IRAK1 siRNA II #6228 (+) 转染的 Hela 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb 可确认 IRAK1 的表达沉默,而 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb 可用作上样对照。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 23 Expand Image
    使用 Phospho-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2) XP® Rabbit mAb(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线)对用 TPA(80 nM,4 天)#9905 分化、未经处理(蓝色)或已经过 LPS(1 ug/ml,1 小时;绿色)#14011 处理的 THP-1 细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 用作二抗。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 24 Expand Image
    使用 TBK1/NAK (E8I3G) Rabbit mAb(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线)对 TALL-1 细胞(蓝色,阴性)和 Raji 细胞(绿色,阳性)进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 25 Expand Image
    使用 IRAK1 (D51G7) Rabbit mAb 对未经 Raw264.7 细胞、IRAK1 shRNA(蓝色)或 +GFP shRNA(绿色)进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 fragment (Alexa Fluor® 647 conjugate) #4414 用作二抗。
    Myddosome Complex Antibody Sampler Kit: Image 26 Expand Image
    使用 MyD88 (D80F5) Rabbit mAb 对 CHO、BHK-21 和 A549 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。