Revision 1

#15792Store at -20C

1 个试剂盒

(7 x 20 microliters)

Cell Signaling Technology

Orders: 877-616-CELL (2355) [email protected]

Support: 877-678-TECH (8324)

Web: [email protected] cellsignal.com

3 Trask LaneDanversMassachusetts01923USA
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
Product Includes Product # Quantity Mol. Wt Isotype/Source
HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb 36169 20 µl 120 kDa Rabbit IgG
Hydroxy-HIF-1α (Pro564) (D43B5) XP® Rabbit mAb 3434 20 µl 120 kDa Rabbit IgG
HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 5537 20 µl 87 kDa Rabbit IgG
HIF-2α (D6T8V) Rabbit mAb 59973 20 µl 120 kDa Rabbit IgG
FIH (D19B3) Rabbit mAb 4426 20 µl 42 kDa Rabbit IgG
PHD-2/Egln1 (D31E11) Rabbit mAb 4835 20 µl 50 kDa Rabbit IgG
VHL Antibody 68547 20 µl 18-22 kDa Rabbit 
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074 100 µl Goat 

Please visit cellsignal.com for individual component applications, species cross-reactivity, dilutions, protocols, and additional product information.

Description

The Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit provides an economical means to investigate select proteins involved in the hypoxia pathway. The kit contains enough primary antibodies to perform two western blot experiments with each primary antibody.

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibodies.

Background

Hypoxia-inducible factor 1 (HIF1) is a heterodimeric transcription factor that plays a critical role in the cellular response to hypoxia (1). The HIF1 complex consists of two subunits, HIF-1α and HIF-1β, which are basic helix-loop-helix proteins of the PAS (Per, ARNT, Sim) family (2). HIF1 regulates the transcription of a broad range of genes that facilitate responses to the hypoxic environment, including genes regulating angiogenesis, erythropoiesis, cell cycle, metabolism, and apoptosis. The widely expressed HIF-1α is typically degraded rapidly in normoxic cells by the ubiquitin/proteasomal pathway. Under normoxic conditions, HIF-1α is proline hydroxylated leading to a conformational change that promotes binding to the von Hippel-Lindau protein (VHL) E3 ligase complex; ubiquitination and proteasomal degradation follows (3,4). Both hypoxic conditions and chemical hydroxylase inhibitors (such as desferrioxamine and cobalt) inhibit HIF-1α degradation and lead to its stabilization. In addition, HIF-1α can be induced in an oxygen-independent manner by various cytokines through the PI3K-AKT-mTOR pathway (5-7).

HIF-1β is also known as AhR nuclear translocator (ARNT) due to its ability to partner with the aryl hydrocarbon receptor (AhR) to form a heterodimeric transcription factor complex (8). Together with AhR, HIF-1β plays an important role in xenobiotics metabolism (8). In addition, a chromosomal translocation leading to a TEL-ARNT fusion protein is associated with acute myeloblastic leukemia (9). Studies also found that ARNT/HIF-1β expression levels decrease significantly in pancreatic islets from patients with type 2 diabetes, suggesting that HIF-1β plays an important role in pancreatic β-cell function (10).

Hypoxia-inducible factor (HIF) is essential for the cellular response to hypoxia (11,12). There are several isoforms of the HIF α subunit. Studies have found that HIF-1α and HIF-2α expression is increased in some human cancers. HIF-1α has both pro- and anti-proliferative activities, whereas HIF-2α does not possess anti-proliferative activity (12). Therefore, HIF-2α likely plays an important role in tumorigenesis (12,13).

FIH (Factor inhibiting HIF-1, HIF asparagine hydroxylase) is a dioxygen-dependent asparaginyl hydroxylase that modifies target protein function by hydroxylating target protein asparagine residues (14-16). HIF, a transcriptional activator involved in control of cell cycle in response to hypoxic conditions, is an important target for FIH regulation. FIH functions as an oxygen sensor that regulates HIF function by hydroxylating at Asn803 in the carboxy-terminal transactivation domain (CAD) of HIF (17,18). During normoxia, FIH uses cellular oxygen to hydroxylate HIF-1 and prevent interaction of HIF-1 with transcriptional coactivators, including the CBP/p300-interacting transactivator. Under hypoxic conditions, FIH remains inactive and does not inhibit HIF, allowing the activator to regulate transcription of genes in response to low oxygen conditions (17-19). FIH activity is regulated through interaction with proteins, including Siah-1, which targets FIH for proteasomal degradation (20). The Cut-like homeodomain protein CDP can bind the FIH promoter region to regulate FIH expression at the transcriptional level (21). Phosphorylation of HIF at Thr796 also can prevent FIH hydroxylation on Asn803 (22). Potential FIH substrates also include proteins with ankyrin repeat domains, such as Iκ-B, Notch, and ASB4 (23-25).

PHD1 (Egln2), PHD-2 (Egln1), and PHD3 (Egln3) are members of the Egln family of proline hydroxylases. They function as oxygen sensors that catalyze the hydroxylation of HIF on prolines 564 and 402, initiating the first step of HIF degradation through the VHL/ubiquitin pathway (26,27).

  1. Sharp, F.R. and Bernaudin, M. (2004) Nat Rev Neurosci 5, 437-48.
  2. Wang, G.L. et al. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A 92, 5510-4.
  3. Jaakkola, P. et al. (2001) Science 292, 468-72.
  4. Maxwell, P.H. et al. (1999) Nature 399, 271-5.
  5. Fukuda, R. et al. (2002) J Biol Chem 277, 38205-11.
  6. Jiang, B.H. et al. (2001) Cell Growth Differ 12, 363-9.
  7. Laughner, E. et al. (2001) Mol Cell Biol 21, 3995-4004.
  8. Walisser, J.A. et al. (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101, 16677-82.
  9. Salomon-Nguyen, F. et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6757-62.
  10. Gunton, J.E. et al. (2005) Cell 122, 337-49.
  11. Kaelin, W.G. (2005) Biochem Biophys Res Commun 338, 627-38.
  12. Toschi, A. et al. (2008) J Biol Chem 283, 34495-9.
  13. Gordan, J.D. and Simon, M.C. (2007) Curr Opin Genet Dev 17, 71-7.
  14. Koivunen, P. et al. (2004) J Biol Chem 279, 9899-904.
  15. Linke, S. et al. (2004) J Biol Chem 279, 14391-7.
  16. Lisy, K. and Peet, D.J. (2008) Cell Death Differ 15, 642-9.
  17. Mahon, P.C. et al. (2001) Genes Dev 15, 2675-86.
  18. Lando, D. et al. (2002) Genes Dev 16, 1466-71.
  19. Lando, D. et al. (2002) Science 295, 858-61.
  20. Fukuba, H. et al. (2007) Biochem Biophys Res Commun 353, 324-9.
  21. Li, J. et al. (2007) Mol Cell Biol 27, 7345-53.
  22. Lancaster, D.E. et al. (2004) Biochem J 383, 429-37.
  23. Ferguson, J.E. et al. (2007) Mol Cell Biol 27, 6407-19.
  24. Cockman, M.E. et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103, 14767-72.
  25. Cockman, M.E. et al. (2009) Mol Cell Proteomics 8, 535-46.
  26. Freeman, R.S. et al. (2003) Mol Cells 16, 1-12.
  27. Villar, D. et al. (2007) Biochem J 408, 231-40.

Background References

    Trademarks and Patents

    Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    XP is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    All other trademarks are the property of their respective owners. Visit cellsignal.com/trademarks for more information.

    限制使用

    除非 CST 的合法授书代表以书面形式书行明确同意，否书以下条款适用于 CST、其关书方或分书商提供的书品。 任何书充本条款或与本条款不同的客书条款和条件，除非书 CST 的合法授书代表以书面形式书独接受， 否书均被拒书，并且无效。

    专品专有“专供研究使用”的专专或专似的专专声明， 且未专得美国食品和专品管理局或其他外国或国内专管机专专专任何用途的批准、准专或专可。客专不得将任何专品用于任何专断或治专目的， 或以任何不符合专专声明的方式使用专品。CST 专售或专可的专品提供专作专最专用专的客专，且专用于研专用途。将专品用于专断、专防或治专目的， 或专专售（专独或作专专成）或其他商专目的而专专专品，均需要 CST 的专独专可。客专：(a) 不得专独或与其他材料专合向任何第三方出售、专可、 出借、捐专或以其他方式专专或提供任何专品，或使用专品制造任何商专专品，(b) 不得复制、修改、逆向工程、反专专、 反专专专品或以其他方式专专专专专品的基专专专或技专，或使用专品开专任何与 CST 的专品或服专专争的专品或服专， (c) 不得更改或专除专品上的任何商专、商品名称、徽专、专利或版专声明或专专，(d) 只能根据 CST 的专品专售条款和任何适用文档使用专品， (e) 专遵守客专与专品一起使用的任何第三方专品或服专的任何专可、服专条款或专似专专

    Orders: 877-616-CELL (2355)•[email protected]• Support: 877-678-TECH (8324)•[email protected]• Web: cellsignal.com
    仅供研究使用。不得用于诊断流程。
    Revision 1
    #15792

    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit

    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 1 Expand Image
    Simple Western™ analysis of lysates (0.1 mg/mL) from U-937 cells using VHL Antibody #68547. 虚拟泳道式图像（左图）显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的靶标条带（如图所示）。对应的电泳图（右图）为一抗稀释比例在 1:10（蓝线）和 1:50（绿线）时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。在还原条件下，使用 2-40 kDa 分离模块在 ProteinSimple（BioTechne 品牌）的 Jess™ Simple Western 仪器上进行该实验。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 2 Expand Image
    使用 Hydroxy-HIF-1α (Pro564) (D43B5) XP® Rabbit mAb（上图）或总 HIF-1α Antibody #3716（下图），对用 10 μM 的 MG132（累积羟基化 HIF-1α ）或 10 µM MG132 和 1 mM DMOG（累积非羟基化 HIF-1α）处理的 HeLa 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 3 Expand Image
    使用 HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb（上图）或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图），对未经 (-) 或已经氯化钴（100 µM，4 小时；+）处理的 Hep G2 细胞、未经 (-) 或已经氯化钴（100 µM，4 小时；+）处理的 Raji 细胞或未经 (-) 或已经 DMOG（1 mM，6 小时；+）处理的 U-2 OS 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 4 Expand Image
    使用 FIH (D19B3) Rabbit mAb 对来自不同细胞类型的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 5 Expand Image
    使用 PHD-2/Egln1 (D31F11) Rabbit mAb 对不同细胞类型的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 6 Expand Image
    使用 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 时，来自不同细胞类型的提取物的蛋白质印迹分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 7 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，以经过 BNF（1 µM）处理 45 分钟的 T47D 细胞和 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。该图显示结合作用遍及 PEX11B 基因。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 8 Expand Image
    使用 HIF-2α (D6T8V) 兔单克隆抗体 对 786-O 和 A498 细胞的提取物进行蛋白印迹分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 9 Expand Image
    使用 VHL Antibody（上图）和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457（下图）对不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。注意，786-O 是一种缺失 VHL 的细胞系，表明具有抗体特异性。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 10 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后，与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®，在酶催化分解期间发光。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 11 Expand Image
    使用 Hydroxy-HIF-1α (Pro564) (D43B5) XP® Rabbit mAb（绿色），对用 10 μM MG132（左）或 10 μM MG132 和 1 mM DMOG（右）处理的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白纤丝已用 DY-554 phalloidin（红色）标记。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 12 Expand Image
    对经氯化钴（100 µM，4 小时）处理的 Hep G2 细胞裂解物的 HIF-1α 进行免疫沉淀。泳道 1 为 10 % input，泳道 2 为 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900，泳道 3 为 is HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb。使用 HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb 进行蛋白质印迹分析。Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 用作二抗。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 13 Expand Image
    在对照肽（左）或抗原特异性肽（右）存在的情况下，使用 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 时，石蜡包埋的人类乳腺癌的免疫组织化学分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 14 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，以经过 BNF（1 µM）处理 45 分钟的 T47D 细胞和 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 进行 CUT&RUN。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。该图显示结合作用遍及染色体 1（上图），包括 PEX11B（下图）。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 15 Expand Image
    使用 HIF-2α (D6T8V) 兔单克隆抗体（上图）或 β-肌动蛋白 (D6A8) 兔单克隆抗体 #8457（下图）对未经 (-) 或已经氯化钴（CoCl2，100 μM，4 小时，+）处理的 Hep G2 细胞进行蛋白印迹分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 16 Expand Image
    使用 HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb（绿色）对未经（左图）或经氯化钴（500 μM，24 小时；右图）处理的 HepG2 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白微丝由 DyLight™ 554 Phalloidin #13054（红色）标记。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 17 Expand Image
    使用 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 时，石蜡包埋的人类肺癌的免疫组织化学分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 18 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，对经过 BNF（1 µM）处理 45 分钟的 T47D 细胞和 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN。使用人 ERCC6 启动子引物和人 DPPA2 内含子 1 引物，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 19 Expand Image
    使用 SimpleChIP® 酶解染色质免疫共沉淀试剂盒（磁珠法） #9005 对经氯化钴 (100 μM) 过夜处理的 Hep3B2.1-7 细胞的交联染色质与 HIF-2α (D6T8V) 兔单克隆抗体 #59973 或正常兔 IgG #2729 进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® 人源 PAI-1 启动子引物 #33070、人源 EPO 启动子引物和 SimpleChIP® 人源 α 卫星重复序列引物 #4486 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 20 Expand Image
    使用 HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb（实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype control #3900（虚线），对未经处理（蓝色）或已经 DMOG (1 mM，6 小时；绿色）处理的 U-2 OS 细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 21 Expand Image
    使用 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 时，石蜡包埋的小鼠结肠的免疫组织化学分析。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 22 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经氯化钴 (100 μM) 过夜处理的MCF7 细胞中提取的交联染色质，在加入HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb后，进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。本图显示在 ARRDC3（HIF-1α 的一个已知靶基因）内的结合作用（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他图）。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 23 Expand Image
    使用 SimpleChIP® 酶解染色质免疫共沉淀试剂盒（磁珠法） #9005 对经 BNF (1μM) 处理 45 分钟的 T47D 细胞的交联染色质与 HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® 兔单克隆抗体进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。本图显示在 CYP1A2（HIF-1β的一个已知靶基因）内的结合作用（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他图）。如需了解其他 ChIP-seq 情况，请下载产品说明书。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 24 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经氯化钴 (100 μM) 过夜处理的MCF7 细胞中提取的交联染色质，在加入HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb后，进行染色质免疫沉淀。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体 5（上图）内的结合，包括 HIF-1α 的已知靶标基因 ARRDC3（下图）（参见包含 ChIP-qPCR 数据的其他结果图）。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 25 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003，对T47D 细胞（用 BNF (1 μM) 处理 45 分钟）中提取的交联染色质，在加入HIF-1β/ARNT (D28F3) XP® Rabbit mAb 或Normal Rabbit IgG #2729后，进行染色质免疫沉淀。使用 SimpleChIP® Human NFE2L2 Intron 1 Primers #81126、人 CYP1A1 启动子引物和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA进行定量。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 26 Expand Image
    使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，对经氯化钴(100 μM) 过夜处理的 MCF7 细胞中提取交联染色质，在加入 HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb 或 Normal Rabbit IgG #2729 后，进行染色质免疫沉淀。使用 human ARRDC3 downstream primers, SimpleChIP® Human ERRFI1 Upstream Primers #31180 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行量化。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 27 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #100，对经过氯化钴（ μM）过夜处理的 MCF7 细胞和 HIF-1α (D1S7W) XP®86652 Rabbit mAb 进行 CUT&RUN 分析。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在 STC2 内结合，STC2 是一种已知的 HIF-1α 靶标基因（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 28 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #100，对经过氯化钴（ μM）过夜处理的 MCF7 细胞和 HIF-1α (D1S7W) XP®86652 Rabbit mAb 进行 CUT&RUN 分析。使用 DNA Library Prep Kit for Illumina® (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 库。结果图显示在染色体 5（上图）内的接合，包括 HIF-1α 的已知靶基因 STC2（下图）（参见包含 CUT&RUN-qPCR 数据的其他结果图）。
    Hypoxia Pathway Antibody Sampler Kit: Image 29 Expand Image
    使用 CUT&RUN Assay Kit #66362，对经过氯化钴（100 μM）过夜处理的 MCF7 细胞和 HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #86652 进行 CUT&RUN 分析。使用human STC2 exon 1 primers、human FAM162A promoter primers 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486，通过实时 PCR 对富集的 DNA 进行定量分析。将每份样品中免疫沉淀的 DNA 的量表现为相对于所输入染色质总量（等于 1）的信号。
    图像库
    更多了解我们如何获得图像
    Orders: 877-616-CELL (2355)•[email protected]• Support: 877-678-TECH (8324)•[email protected]• Web: cellsignal.com
    仅供研究使用。不得用于诊断流程。