Revision 1

#64459Store at -20C

1 个试剂盒

(6 x 20 microliters)

Cell Signaling Technology

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Web: [email protected] cellsignal.com

3 Trask LaneDanversMassachusetts01923USA
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.
Product Includes Product # Quantity Mol. Wt Isotype/Source
LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb 4599 20 µl 14, 16 kDa Rabbit IgG
LC3B (D11) XP® Rabbit mAb 3868 20 µl 14, 16 kDa Rabbit IgG
LC3C (D3O6P) Rabbit mAb 14736 20 µl 14 kDa Rabbit IgG
GABARAP (E1J4E) Rabbit mAb 13733 20 µl 14, 16 kDa Rabbit IgG
GABARAPL1 (D5R9Y) XP® Rabbit mAb 26632 20 µl 14, 16 kDa Rabbit IgG
GABARAPL2 (D1W9T) Rabbit mAb 14256 20 µl 14 kDa Rabbit IgG
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody 7074 100 µl Goat 

Please visit cellsignal.com for individual component applications, species cross-reactivity, dilutions, protocols, and additional product information.

Description

The Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit provides an economical means of detecting each of the Atg8 family members. The kit contains enough primary antibody to perform at least two western blot experiments.

Storage

Supplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% glycerol and less than 0.02% sodium azide. Store at –20°C. Do not aliquot the antibody.

Background

Autophagy is a catabolic process for the autophagosomic-lysosomal degradation of bulk cytoplasmic contents (1,2). Autophagy is generally activated by conditions of nutrient deprivation, but it has also been associated with a number of physiological processes, including development, differentiation, neurodegenerative diseases, infection, and cancer (3).
Atg8 is a ubiquitin-like protein that is critical for autophagosome formation. Atg8 is synthesized as a precursor protein that is processed by the cysteine protease Atg4, followed by lipidation with phosphatidylethanolamine (PE) in a ubiqutin-like conjugation pathway involving Atg7 and Atg3 (4). This processing of Atg8, which is described as a conversion from type-I to type-II forms, is frequently described as a marker for autophagy. The type-II form of Atg8 is incorporated into maturing autophagosomes and leads to the recruitment of additional autophagy components, including cargo receptors like SQSTM1/p62. While yeast has a single Atg8 gene, many eukaryotes have at least six orthologs, including three microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3/LC3) family members (LC3A, LC3B, and LC3C) and three GABAA receptor associated protein (GABARAP) family members (GABARAP, GABARAPL1/GEC1, and GABARAPL2/GATE-16). While highly conserved, these various family members can have important differences in their post-translational processing, expression profile, and protein interactions including distinct cargo receptor. This complexity within the Atg8 family is critical for selective mechanisms of autophagy that have been reported (5, 6).

  1. Reggiori, F. and Klionsky, D.J. (2002) Eukaryot Cell 1, 11-21.
  2. Codogno, P. and Meijer, A.J. (2005) Cell Death Differ 12 Suppl 2, 1509-18.
  3. Levine, B. and Yuan, J. (2005) J Clin Invest 115, 2679-88.
  4. Ichimura, Y. et al. (2000) Nature 408, 488-92.
  5. Slobodkin, M.R. and Elazar, Z. (2013) Essays Biochem 55, 51-64.
  6. Schaaf, M.B. et al. (2016) FASEB J 30, 3961-3978.

Background References

    Trademarks and Patents

    Cell Signaling Technology is a trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
    XP is a registered trademark of Cell Signaling Technology, Inc.
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    Revision 1
    #64459

    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit

    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 1 Expand Image

    使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb #3868 对来自氯喹(50uM,O/N)处理的 HeLa 细胞的裂解物 (1mg/ml) 进行 Simple Western™ 分析。虚拟泳道式图像(左图)显示一抗稀释比例为 1:10 和 1:50 时的靶标条带(如图所示)。对应的电泳图(右图)为一抗稀释比例在 1:10(蓝线)和 1:50(绿线)时沿毛细血管内分子量的化学发光结果。使用 2-40 kDa 分离模块在 BioTechne 旗下品牌 ProteinSimple 的 Jess™ Simple Western 仪上还原性条件下进行该实验。

    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 2 Expand Image
    使用 GABARAP (E1J4E) Rabbit mAb 对未处理的 (-) 或经氯喹处理(50 μM,过夜; +)的 A172 和 C2C12 细胞进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 3 Expand Image
    使用 GABARAPL2 (D1W9T) Rabbit mAb(上图)或 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下图)对用 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® GABARAPL2 siRNA I # 14239 (+) 或 SignalSilence® II GABARAPL2 siRNA II #14246 (+) 转染的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。GABARAPL2 (D1W9T) Rabbit mAb 可证实 GABARAPL2 沉默,而使用 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb 作为上样对照。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 4 Expand Image
    使用 LC3C (D3O6P) Rabbit mAb(上)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下),对未经处理 (-) 或经 chloroquine 处理(50 μM,过夜;+)的 A172 和 HOP-92 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 5 Expand Image
    使用 GABARAPL1 (D5R9Y) XP® Rabbit mAb(上)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下),对转染空载 (-) 或转染 Myc/DDK 标记全长人 GABARAP 蛋白(hGABARAP-Myc/DDK;+)、人 GABARAPL1 蛋白(hGABARAPL1-Myc/DDK;+)或人 GABARAPL2 蛋白(hGABARAPL2-Myc/DDK;+)表达载体的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 6 Expand Image
    使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb #3868(上图)或 GAPDH (D16H11) XP® Rabbit mAb #5174(下图)对未经处理 (-) 或经过 Chloroquine #14774(50 μM,18 小时)处理的 HCT 116 和 HCT 116 LC3B 敲除型细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。HCT 116 敲除型细胞中没有信号,这证实了抗体对 LC3B 的特异性。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 7 Expand Image
    使用 LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb 对未处理或用氯喹处理(50 μM,过夜)的 HeLa 和 NIH/3T3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 8 Expand Image
    一抗与靶标蛋白结合之后,与偶联 HRP 的二抗形成复合体。添加 LumiGLO®,在酶催化分解期间发光。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 9 Expand Image
    使用 GABARAP (E1J4E) Rabbit mAb 对转染空载 (-) 或经构建表达 Myc/DDK 标记全长人 GABARAP (hGABARAP-Myc/DDK; +)、人 GABARAPL1 (hGABARAPL1-Myc/DDK; +) 或人 GABARAPL2 (hGABARAPL2-Myc/DDK; +) 转染的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 10 Expand Image
    使用 GABARAPL2 (D1W9T) Rabbit mAb,对来自不同细胞系的提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 11 Expand Image
    使用 LC3C (D3O6P) Rabbit mAb,对转染空载 (-) 或转染全长人 LC3A 蛋白 (hLC3A; +)、人 LC3B 蛋白 (hLC3B; +) 或人 LC3C 蛋白表达载体 (hLC3C; +) 的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 12 Expand Image
    使用 GABARAPL1 (D5R9Y) XP® Rabbit mAb(上)和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457(下),对未处理 (-) 或用氯喹处理(50 μM,过夜;+)的 HeLa 细胞、C2C12 细胞和 C6 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 13 Expand Image
    使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb #3868 and α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb #2125 对用 100 nM SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated) #6568 (-)、SignalSilence® LC3B siRNA I #6212 (+) 或 SignalSilence® LC3B siRNA II #6213 (+) 转染的 HeLa 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。LC3B (D11) XP® Rabbit mAb 可确认 LC3B 的表达沉默,而 α-Tubulin (11H10) Rabbit mAb 则用于 LC3B siRNA 的上样和特异性对照。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 14 Expand Image
    使用 LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋的人类多形性恶性胶质瘤进行免疫组织化学分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 15 Expand Image
    使用 GABARAP (E1J4E) Rabbit mAb(绿色)和 β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700(红色)对未处理的(左图)和经氯喹处理(50 μM,过夜;右图)的 A172 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 16 Expand Image
    使用 GABARAPL2 (D1W9T) Rabbit mAb,对转染空载 (-) 或转染 Myc/DDK 标记全长人 GABARAP(hGABA染RAP-Myc/DDK;+)、人 GABARAPL1(hGABARAPL1-Myc/DDK;+)或人 GABARAPL2(hGABARAPL2-Myc/DDK;+)的表达载体的 293T 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 17 Expand Image
    使用 GABARAPL1 (D5R9Y) XP® Rabbit mAb(绿色)和 β-Actin (8H10D10) Mouse mAb #3700(红色),对未处理(左)或用氯喹处理(50 μM,24 小时;右)的 HeLa 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。蓝色伪彩 = DRAQ5® #4084(DNA 荧光染料)。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 18 Expand Image
    使用 LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb(左)对石蜡包埋的人类结肠癌进行免疫组织化学分析或

    Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(右)对石蜡包埋的人类结肠癌进行免疫组织化学分析。

    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 19 Expand Image
    使用 GABARAPL2 (D1W9T) Rabbit mAb(上)或 β-肌动蛋白 (D6A8) #8457(下),对未处理 (-) 或经氯喹处理过夜 (50 μM) (+) 的 A172 细胞和 HeLa 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 20 Expand Image
    使用与浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(红色)相对比的 GABARAPL1 (D5R9Y) XP® Rabbit mAb(蓝色),对 HeLa 细胞进行流式细胞分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 21 Expand Image
    使用 LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb 对石蜡包埋对照组(左)或氯喹处理组(右)HeLa 细胞沉淀物进行免疫组织化学分析。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 22 Expand Image
    使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb(绿色)对未经处理(左图)或经过 Chloroquine #14774(50 µM,过夜)(中图)处理的 HCT 116 细胞或经过 Chloroquine #14774(50 µM,过夜)(右图)处理的 LC3B HCT 116 敲除型细胞进行共聚焦免疫荧光分析。肌动蛋白丝用 β-Actin (8H10D10) Mouse mAb(红色)标记,胞核用 DAPI #4083(蓝色)标记。
    Autophagy Atg8 Family Antibody Sampler Kit: Image 23 Expand Image
    使用 LC3B (D11) XP® Rabbit mAb #3868(实线)或浓度匹配的 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900(虚线)对野生型(绿色,高表达)或 LC3B 敲除型(蓝色,低表达)的 HCT-116 细胞进行共聚焦免疫荧光分析。Anti-rabbit IgG (H+L)、F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412 作为二抗。