Cat. # | Size | Price | Inventory |
---|---|---|---|
65221S | 100 µl (50 tests) |
REACTIVITY | H M R Mk |
SENSITIVITY | Endogenous |
MW (kDa) | |
Source/Isotype | Rabbit IgG |
Product Information
Application | Dilution |
---|---|
Flow Cytometry (Fixed/Permeabilized) | 1:50 |
All reagents required for this protocol may be efficiently purchased together in our Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593, or individually using the catalog numbers listed below.
NOTE: Prepare solutions with reverse osmosis deionized (RODI) or equivalent grade water.
NOTE: When including fluorescent cellular dyes in your experiment (including viability dyes, DNA dyes, etc.), please refer to the dye product page for the recommended protocol. Visit www.cellsignal.com for a full listing of cellular dyes validated for use in flow cytometry.
NOTE: Adherent cells or tissue should be dissociated and in single-cell suspension prior to fixation.
NOTE: Optimal centrifugation conditions will vary depending upon cell type and reagent volume. Generally, 150-300g for 1-5 minutes will be sufficient to pellet the cells.
NOTE: If using whole blood, lyse red blood cells and wash by centrifugation prior to fixation.
NOTE: Antibodies targeting CD markers or other extracellular proteins may be added prior to fixation if the epitope is disrupted by formaldehyde and/or methanol. The antibodies will remain bound to the target of interest during the fixation and permeabilization process. However, note that some fluorophores (including PE and APC) are damaged by methanol and thus should not be added prior to permeabilization. Conduct a small-scale experiment if you are unsure.
NOTE: Count cells using a hemocytometer or alternative method.
posted July 2009
revised June 2020
实验步骤编号:407
人, 小鼠, 大鼠, 猴
仓鼠 , 鸡 , 斑马鱼 , 牛 , 马
使用与人组蛋白 H2B 蛋白的乙酰化 Lys5 周围的残基相对应的合成肽对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。
核小体由四个核心组蛋白(H2A、H2B、H3 和 H4)组成,是染色质的主要组成部分。组蛋白最初被视为作为 DNA 包装的静态支架蛋白起作用,但现在已被证明是一种经过多种类型的翻译后修饰的动态蛋白,包括乙酰化、磷酸化、甲基化和泛素化 (1,2)。在转录激活期间,p300/CBP 组蛋白乙酰转移酶在基因启动子上乙酰化组蛋白 H2B 氨基末端尾区的多个赖氨酸残基(Lys5、12、15 和 20)(1-3)。组蛋白尾区的过度乙酰化会中和这些结构域的正电荷,弱化组蛋白-DNA 和核小体之间的相互作用,因此会导致染色质结构不稳定,增加进入不同 DNA 结合蛋白的 DNA (4,5)。此外,特定赖氨酸残基的乙酰化会形成锚定位点,有助于募集包含溴结构域的许多转录和染色质调节蛋白,进而结合乙酰化赖氨酸残基 (6)。在转录激活期间,RAD6 E2 蛋白和 BRE1A/BRE1B E3 连接酶(也称为 RNF20/RNF40)在 Lys120 位点单泛素化组蛋白 H2B (7)。单泛素化组蛋白 H2B Lys120 与激活基因的转录区域有关,并通过促进 FACT 依赖性染色质重构刺激转录延长 (7-9)。此外,组蛋白 H3 Lys4 和 Lys79 的后续甲基化也很重要,因为这是调节转录起始和延长的其他两种组蛋白修饰 (10)。在代谢应激的刺激下,AMPK 被募集到应答基因,并在启动子和基因转录区域的 Lys36 位点磷酸化组蛋白 H2B,进而调节转录延长 (11)。在多种细胞凋亡刺激物的刺激下,Mst1 激酶磷酸化组蛋白 H2B 的 Ser14 位点 (12)。在诱导细胞凋亡后,caspase-3 裂解和激活 Mst1,导致组蛋白 H2B 在染色质凝聚期间被全部磷酸化。有趣的是,组蛋白 H2B 在小鼠胚胎成纤维细胞的辐射诱导性 DNA 损伤基因座中被快速磷酸化 (13)。在此情况下,根据 H2AX Ser139 之前的磷酸化,Ser14 位点的磷酸化十分迅速,并且在凋亡不存在的情况下发生,表明 Ser14 磷酸化可能在 DNA 损伤修复和细胞凋亡中起明显作用。
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